通过模型蛋白的热变性评估细菌分子伴侣活性

摘要

来源： Dahl, J. 等 pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 在体 内. 视频实验杂志 (2016)

本视频展示了一种基于荧光分光光度计的检测方法，用于评估在酸性和热应激条件下分子伴侣对底物蛋白的保护活性。该方法通过光散射监测底物蛋白的去折叠和聚集过程，并比较有无分子伴侣存在时的不同条件。

方案

1. 利用热变性苹果酸脱氢酶（MDH）检测分子伴侣活性

注意： 不同 pH 值下纯化的 HdeB 对热变性猪线粒体苹果酸脱氢酶（MDH）聚集的影响监测方法如下所述。所有列出的蛋白质浓度均指单体浓度。

1. 为制备MDH，将MDH在4 °C下于4 L缓冲液C（50 mM磷酸钾，50 mM氯化钠（NaCl），pH 7.5）中透析过夜，并使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置将蛋白浓缩至约100 µM。
   注意：必须仔细进行MDH透析，因为MDH以硫酸铵溶液形式提供。
2. 为去除聚集体，将蛋白在4 °C下以20,000 × g离心20分钟。通过280 nm处的吸光度测定MDH浓度（ε_{280 nm} = 7,950 M^-1 cm^-1）。将MDH分装为50 µl每份，并迅速冷冻后储存。
3. 将1 ml石英比色皿放入配备温度控制样品架和搅拌器的荧光分光光度计中。设置激发/发射波长（λ_ex/em ）为350 nm。
4. 向比色皿中加入适量预热至43 °C的缓冲液D（150 mM磷酸钾，150 mM NaCl），调节至所需pH值（此处为pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0和pH 5.0），并将样品架温度设定为43 °C。总体积为1,000 µl。
5. 向缓冲液中加入12.5 µM HdeB（或作为缓冲对照，加入等体积的HdeB储存缓冲液），随后加入0.5 µM MDH。开始监测光散射。孵育反应360秒，以确保MDH充分去折叠。
6. 通过加入0.16–0.34体积的2 M无缓冲K₂HPO₄将pH升至7，并继续记录光散射440秒。
7. 将中和后某一特定时间点（此处为500秒，即MDH光散射达到最大值时）在无分子伴侣存在下记录的MDH聚集程度设为100%。在每个指定pH值下，将HdeB的活性归一化为无HdeB时MDH的光散射信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苹果酸脱氢酶（MDH）	Roche	10127914001
磷酸二氢钾（一碱）	Fisher Scientific	BP362-500
磷酸氢二钾（二碱）	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 荧光分光光度计	Hitachi	FL25
荧光比色皿	Hellma Analytics	119004F-10-40
盐酸	Fisher Scientific	A144-212
氢氧化钠	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 离心滤膜装置 30K	Millipore	UFC803024
氯化钠	Fisher Scientific	S271-10
Spectra/Por 1 透析膜，截留分子量：6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Varian Cary 50 分光光度计	Agilent Tech