评估酸激活的分子伴侣在酸胁迫下对 E. coli 的保护作用

摘要

来源： Dahl, J., 等pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 体内. 视频实验杂志 (2016)

本视频展示了利用重组大肠杆菌（E. coli）培养物评估酸激活分子伴侣在酸胁迫条件下保护作用的方法。通过监测细菌生长，发现表达分子伴侣的培养物相较于对照组具有更高的存活率，凸显了分子伴侣在胁迫条件下对蛋白质稳定的保护功能。

方案

1. 伴侣蛋白 HdeB 过表达对E. coli在酸胁迫条件下存活率的影响

注意： E. coli 使用标准方案提取MG1655基因组DNA。

1. 使用引物 hdeB-BamHI-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT 和 hdeB-EcoRI-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C，通过 PCR 从 E. coli MG1655 中扩增分子伴侣 hdeB。
2. 按如下体系配制 50 µl PCR 反应：10 µl 5x 聚合酶缓冲液，200 µM dNTPs，0.5 µM 引物 JUD2，0.5 µM 引物 JUD5，150 ng MG1655 基因组 DNA，0.5 µl DNA 聚合酶，用 ddH₂O 补足至 50 µl。
3. 按以下程序进行 hdeB 的扩增：第一步：95 °C 预变性 5 分钟，1 个循环；第二步：95 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒，共 40 个循环；第三步：72 °C 延伸 10 分钟。
4. 将所得 PCR 片段通过限制性克隆的标准方法插入质粒 pBAD18 的 EcoRI 和 BamHI 位点。按照制造商说明书，使用质粒提取试剂盒纯化质粒，并通过测序验证所得质粒。
5. 将表达 HdeB 的质粒或空载体对照质粒 pBAD18 转化至菌株 BB7224 (ΔrpoH)（基因型：F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺）的化学感受态细胞中。
   注意：该菌株具有温度敏感性。
6. 在 42 °C 热激 45 秒后，涂板前将细胞于 30 °C、200 rpm 条件下培养。对阳性克隆进行单菌落划线，并于 30 °C 过夜培养。在 50 ml LB_Amp 培养基中制备过夜培养物，并在 200 rpm、30 °C 条件下培养细胞。
7. 将过夜培养物按 40 倍体积稀释至 25 ml LB_Amp 中，在 30 °C、200 rpm 条件下培养细菌，同时加入 0.5% 阿拉伯糖（Ara），使菌液 O.D._600nm 达到 1.0，以诱导 HdeB 蛋白表达。
8. 进行 pH 转移实验时，使用 LB_Amp+Ara 将细胞稀释至 O.D._600nm 为 0.5，然后加入适量 5 M HCl 调节至相应 pH 值（此处为 pH 2.0、pH 3.0 和 pH 4.0）。
9. 在指定时间点（pH 2 时为 1 分钟；pH 3 时为 2.5 分钟；pH 4 时为 30 分钟）后，加入适量 5 M NaOH 中和培养物。
10. 通过 O.D. 测定，在 30 °C 条件下对中和后的培养物进行 12 小时的液体培养，监测其生长情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEB10-beta E. coli 细胞	New England Biolabs	C3019I
氨苄青霉素	Gold Biotechnology	A-301-3
LB 肉汤混合物，Lennox 型	LAB Express	3003
F-4500 荧光分光光度计	Hitachi	FL25
Wizard Plus Miniprep 试剂盒	Promega	A1470	用于质粒纯化
L-阿拉伯糖	Gold Biotechnology	A-300-500
荧光比色皿	Hellma Analytics	119004F-10-40
寡核苷酸	Invitrogen
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530S
dNTP 混合物	Invitrogen	10297018
盐酸	Fisher Scientific	A144-212
氢氧化钠	Fisher Scientific	BP359-500
Veriti 96 孔热循环仪	Thermo Fisher	4375786