利用可变数目串联重复序列（VNTR）分析检测鱼类病原体

摘要

来源：Gulla, S.，等．通过多重PCR和毛细管电泳对鱼类致病性细菌Yersinia ruckeri进行多位点可变数目串联重复序列分析．J. Vis. Exp．(2019)．

本视频演示了利用毛细管电泳分离来自鱼类致病菌的荧光标记可变数目串联重复（VNTR）扩增子，以生成特定大小的电泳图谱，用于细菌鉴定。

方案

1. 毛细管电泳设置与运行条件

1. 确认PCR（聚合酶链式反应）扩增产物后，用纯水将PCR产物按1:10（v/v）稀释。密封、混匀并短暂离心。
2. 在通风橱中操作，为每个PCR产物配制主混合液，包含9 µL甲酰胺和0.5 µL大小标准品（额外准备10%余量）。短暂涡旋混匀后，将9.5 µL混合液加入适用于所用毛细管电泳（CE）系统的反应板孔中，再向每孔加入0.5 µL稀释后的PCR产物。密封、混匀并短暂离心。
   注意：请小心操作。甲酰胺与水混合会生成有毒的甲酸。
3. 使用PCR扩增仪，在95 °C变性样品3分钟，然后无限期冷却至4 °C。短暂离心后，根据仪器制造商的说明，将反应板装载到已校准的CE系统上。
4. 根据所选设备及以下参数，使用相应的试剂进行片段分析毛细管电泳：60 °C；1.6 kV（32 V/cm）条件下进样5秒；15 kV（300 V/cm）条件下运行32分钟。对24孔板（24根毛细管，50 cm）进行CE片段分析通常约需50分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Avant 3500xL 遗传分析仪	Thermo Fisher Scientific	A30469	用于毛细管电泳片段分析。
BioNumerics7 模块	Applied Maths	NA	用于基于 MLVA 数据生成最小生成树。
离心机	按需选用。	NA
Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 mL	Eppendorf	30120086	DNA 提取过程中使用的离心管。
冷冻柜	按需选用。	NA
通风橱	按需选用。	NA
GeneMapper 软件 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	用于读取毛细管电泳产生的电泳图谱。
GeneScan 600 LIZ 染料尺寸标准品 v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	毛细管电泳过程中使用的尺寸标准品。
Hi-Di 去离子甲酰胺	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	毛细管电泳过程中使用的去离子甲酰胺。需制备工作分装液。
Milli-Q 水	NA	NA	PCR 和毛细管电泳过程中使用的纯化水。标准配方；实验室自制。
Multiplex PCR Plus 试剂盒	Qiagen	206151/206152
PCR 热循环仪	按需选用。	NA
POP-7 聚合物（适用于 3500 Dx/3500xL Dx 遗传分析仪）	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	毛细管电泳过程中使用的分离基质。
纯培养的耶尔森菌（Yersinia ruckeri）	NA	NA	例如冷冻保存或新鲜培养物。
无 RNase 水	Qiagen	NA	包含于 Multiplex PCR Plus 试剂盒中
Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液	NA	NA	标准配方；实验室自制。
胰蛋白胨大豆琼脂/牛血琼脂	NA	NA	标准配方；实验室自制。
涡旋振荡器	按需选用。	NA