软琼脂覆盖法检测细菌素介导的杀伤作用 Pseudomonas syringae

摘要

来源：Hockett, K. L., 和 Baltrus, D. A. 利用软琼脂覆盖法筛选细菌产生的抑制性化合物。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了通过将抗生素诱导的供体菌株的上清液点样到含有测试菌株的软琼脂覆盖层上，来检测细菌素介导的杀伤作用的实验步骤。培养后形成的透明区域表明细菌生长受到抑制。

方案

1. 准备覆盖层并检测上清液的活性

1. 接种单个菌落的 P. syringae 将待测菌株接种于3 ml KB培养基（King's medium B）中，于室温下振荡培养过夜。
2. 次日早晨，将培养物用新鲜KB培养基按1:100稀释。室温下振荡培养3-4小时。
3. 通过高压灭菌超纯水中含有0.35-0.7%（w/v）琼脂的悬浮液来制备无菌水琼脂。
   注意： 软水琼脂储备液可在微波炉中熔化并反复使用；每次实验无需制备新鲜的覆盖层。若重复使用水琼脂，必须确保微波加热后完全熔化。否则，凝固后的覆盖层将呈现颗粒状质地，影响结果观察与判读。
4. 使用前，将熔融的软琼脂置于60 °C水浴中保存。用无菌刻度吸管吸取3 ml软琼脂，转移至无菌培养管中。将培养管放回水浴，以维持其熔融状态。
5. 倒入覆盖层时，先让熔化的琼脂冷却（触摸时应感觉温热但不烫手），但不要使其凝固。
6. 在无菌操作台中，取100 µl测试菌株培养物接种至软琼脂中，涡旋混匀。手动旋转培养管10–15秒，然后倒入底层琼脂（KB琼脂）表面。倾斜培养皿，使软琼脂均匀覆盖底层琼脂。
   注意： 底层琼脂可采用任何能使测试菌株旺盛生长的已凝固培养基（含1.5%琼脂）。对于标准的100 mm直径培养皿，使用约20 ml融化培养基。底层琼脂可提前数周配制（若在4 °C条件下保存且未干燥），也可在当天配制。
7. 盖上培养皿，静置 20–30 分钟使其凝固。凝固过程中注意不要移动或扰动培养皿。
8. 凝固后，取2-5 µl上清液点加在覆盖层表面。将平板于室温孵育过夜，次日早晨观察并记录结果。
   注意： 进行上清液的系列稀释并点样可能会有帮助。这将使研究人员能够区分噬菌体与细菌素的清除活性。在此情况下，建议进行1:5或1:10的稀释。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丝裂霉素C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	具有致癌性。配制储备液时务必使用适当的个人防护装备（如手套、眼部防护具和面罩）。
细菌学级琼脂	Genesee Scientific	20-274