通过单菌落筛选分离耐受胁迫的细菌

摘要

来源：Jeong, H., et. al．利用恒化器进行微生物适应性实验室进化的实验方案．J. Vis. Exp．（2016）

本视频演示了从长期处于胁迫条件下的培养物中选择性分离和培养胁迫适应性细菌的方法。将培养物接种于含有胁迫因子的琼脂平板上，挑取单菌落接种至含胁迫因子的液体培养基中。通过定期测定吸光度，监测细菌生长情况，以确认胁迫适应性细菌的成功分离。

方案

1. 仪器设备准备

1. 获取一个恒化器瓶（150–250 ml）或带有进液口和出液口的锥形瓶（250 ml）。使用硅胶管连接进出液口，以实现 10–100 ml/hr 的流速。可选地，使用通气口、排气口以及控温水循环的进水口和出水口。
2. 获取一个适用于恒化器罐的装置，该装置可提供搅拌和温度控制功能（或使用旋转振荡培养箱）。
3. 使用两台蠕动泵分别输送新鲜培养基并收集培养物。
4. 获取一个带有培养基出口和空气进口的储液罐（10–20 L）。
5. 获取适用于稀释速率的硅胶管即内径 0.8 mm，流速范围 0.06–36 ml/min；L/S 13 管路。

2. 培养基的配制与灭菌

1. 初始培养基
   1. 在恒化器瓶中，将0.3 g葡萄糖、0.08 g氯化铵（NH₄Cl）、0.05 g氯化钠（NaCl）、0.75 g磷酸氢二钠二水合物（Na₂HPO₄·2H₂O）和0.3 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶解于90 mL蒸馏水（D.W.）中。
   2. 使用夹子将恒化器瓶及连接管路密封，但不要封闭通气口。
   3. 将恒化器瓶在121 °C高压灭菌器中灭菌15分钟。灭菌后，于室温下保存。
   4. 将0.02 g七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、0.01 g氯化钙（CaCl₂）和0.1 mg硫胺素溶解于10 mL D.W.中（溶液A）。
   5. 使用注射器和预先灭菌的注射器滤器（孔径0.45 µm）过滤溶液A。
   6. 将滤过的溶液A加入恒化器瓶中。
2. 胁迫培养基
   1. 在储液瓶中，将30 g葡萄糖、8 g氯化铵（NH₄Cl）、5 g氯化钠（NaCl）、75 g磷酸氢二钠二水合物（Na₂HPO₄·2H₂O）、30 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）和300 g六水合琥珀酸钠（Na₂·succinate·6H₂O；本实验所用的胁迫剂）溶解于9.9 L D.W.中。
   2. 使用夹子将储液瓶及连接管路密封，但不要封闭通气口。
   3. 将储液瓶在121 °C高压灭菌器中灭菌15分钟。灭菌后，于室温下保存。
   4. 将2 g七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、1 g氯化钙（CaCl₂）和10 mg硫胺素溶解于100 mL D.W.中（溶液A）。
   5. 使用注射器和预先灭菌的注射器滤器（孔径0.45 µm）过滤溶液A。
   6. 将滤过的溶液A加入储液瓶中。
   7. 无菌连接灭菌硅胶管至储液瓶，并连接蠕动泵。
3. 高胁迫培养基
   1. 按2.2节方法配制培养基，但提高胁迫剂浓度（i.e.，在琥珀酸适应过程中提高3–5 g/L）。
      注意：本方案适用于可通过培养基施加的胁迫。若为温度、振荡或光照等物理胁迫因素，应相应设计培养条件。

3. 初次培养

1. 接种一个野生型单菌落 大肠杆菌 (E. coli) 在含有4 ml初始培养基的15 ml试管中。
2. 将试管置于摇床培养箱中，在37 °C、220 rpm条件下孵育12小时。
3. 无菌条件下将1 ml预培养物转移至恒化器瓶中。
4. 将恒化器瓶在37 °C下孵育6小时，同时提供通气（空气50 ml/min）和搅拌（200 rpm）。

4. 应激适应

1. 无菌条件下将泵的硅胶管末端连接到恒化器罐。
2. 启动出口泵（10 ml/hr 或更高），收集培养液。注意培养物应处于对数生长期，通常为初次培养后4-8小时。
3. 检测出口管路中培养物的光密度（600 nm）。
4. 启动进样泵（10 ml/hr，对应稀释速率为0.1 hr-1）。
5. 每24小时从出口管路检测一次培养物在600 nm处的光密度。
6. 以恒化器运行96小时（9.6倍体积更换）或更长时间。若光密度稳定，更换含有高应激培养基的储液瓶。若光密度低于0.2，停止进液泵6小时。重新启动进液泵，并确认光密度超过0.2。
7. 逐步增加胁迫剂浓度，通过更换为含有更高浓度胁迫剂的储液器来实现。
8. 当适应培养物达到一个里程碑时，取样例如，一株适应了100 g/L琥珀酸盐胁迫的菌株），并保存用于进一步的基因组分析。
9. 样品保存时，将培养样品（0.5 ml）与灭菌的80%甘油溶液（0.5 ml）混合，于-80 °C保存。注意：如果微生物在 ALE 过程中获得了降解胁迫因子的能力，则发酵罐中的胁迫因子浓度与新鲜储液罐中的浓度不同。

5. 耐受性菌株的单菌落分离

1. 制备含有相同胁迫剂且培养基浓度相同的琼脂平板培养基（1.6% 琼脂）。
2. 取恒化器中的流出菌液（0.1 ml）涂布于平板上，在 37 °C 下培养 16 小时。
3. 用无菌牙签挑取平板上的单菌落，接种至含有与恒化器中相同胁迫剂及相同培养基浓度的 15 ml 试管中，培养 6 小时。
4. 将 1 ml 菌液转移至含有 50 ml 培养基的 250 ml 锥形瓶中。每隔 1 小时收集 0.5 ml 菌液，测定 600 nm 处的光密度（O.D.）。在施加胁迫剂的条件下，比较适应菌株与野生型菌株的生长速率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型恒化器发酵罐	Biotron Inc.	-	按特殊订单制造
硅胶管	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	管路尺寸可根据稀释速率和发酵罐瓶体大小进行调整
储液瓶	Bellco	培养基储存瓶	20 L
化学试剂	Sigma-Aldrich	-	试剂级
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	ACS 试剂
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	分子生物学用，适用于细胞培养，≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS 试剂，≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	ACS 试剂，≥99%
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	ACS 试剂，≥98%
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	ACS 试剂，≥96%
硫胺素·盐酸盐	Sigma-Aldrich	T4625	试剂级，≥99%
Na₂琥珀酸盐·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus，≥99%