筛选海洋细菌以分离降解污染物的菌株

摘要

来源：Villela, H. D. M., 等. 用于共生体研究与保护的生物修复及益生菌开发微生物菌株筛选。JoVE 实验视频杂志 (2019)。

本视频通过连续稀释、菌落筛选以及在含雌酮二乙酯（EE2）培养基中的生长，演示了降解污染物的海洋细菌的分离过程。通过将EE2作为唯一碳源，该方案可鉴定出能够代谢此类环境污染物的细菌菌株。

方案

1. 海水和珊瑚的采集与保存用于微生物分离

注意： 必须记录采样点的坐标和温度。如果可能，盐度、pH、深度和光照强度等元数据也有助于优化培养方法并对后续数据进行解释。为获得可靠结果，应尽可能缩短样品的保存时间。如果样品未在适宜温度下保存和/或长期储存，水体/珊瑚微生物组可能会发生显著变化。若无法在采集后立即进行分离操作，则必须将样品在 4 °C 条件下保存直至处理。即使在 4 °C 下，保存时间越长，微生物群落的变化也越大。

1. 采集并储存海水。
   1. 从每个目标采样点至少采集三份500 mL水样。建议使用带螺旋盖的无菌瓶。
   2. 若在采集后立即处理水样，可将瓶子短暂置于室温（RT）下；若延迟处理，则将瓶子保存于4 °C。
2. 采集并储存珊瑚样本。
   1. 使用无菌镊子从与水样相同的采样点剪取珊瑚碎片。为避免污染，仅用无菌手套接触珊瑚。
   2. 用20 mL无菌生理盐水（3% NaCl溶于蒸馏水中）或无菌人工海水冲洗所采集的珊瑚碎片，以去除附着不牢的海水游离细菌。
   3. 使用镊子将每块珊瑚碎片放入含有无菌生理盐水、带螺旋盖的无菌250−500 mL容器中。
   4. 在实验室中，使用无菌镊子和镊钳，将无菌100 mm × 20 mm培养皿置于天平上，称取5 g珊瑚碎片。
   5. 将5 g珊瑚样品转移至无菌研钵中，并用无菌研杵充分研磨。
   6. 使用无菌刮勺将研磨后的样品转移至含有45 mL 3% NaCl无菌溶液和10−15颗5 mm玻璃珠的无菌培养瓶中。使用部分45 mL无菌生理盐水冲洗研钵，以最大限度回收研磨物。
   7. 将培养瓶置于恒定振荡条件下（150 × g），在采样点水温下孵育16小时。
      注意： 对于浅水珊瑚，最适温度范围为24−28 °C。此步骤可使附着于珊瑚不同部位的微生物（如附着于宿主细胞、组织内部或骨骼中的微生物）脱落。此步骤完成后，珊瑚研磨物不得储存，必须立即进行分离步骤。

2. 从海水和/或珊瑚中分离可降解合成雌激素17α-乙炔基雌二醇（EE2）的细菌

1. 选择细菌。
   注意： 在步骤1.1.2和1.2.7之后，从不同珊瑚匀浆中脱离的海水中微生物浓度未知且可变。为了确保在含有琼脂培养基的培养皿中分离出单个微生物菌落，需要进行系列稀释。
   1. 对珊瑚样本用无菌生理盐水进行连续10倍稀释至10-9，对水样进行连续10倍稀释至10-6。每次弃去枪头前，将稀释液上下吹打5次。每次进行下一次连续稀释前，涡旋振荡样本5秒。
   2. 用移液器将每种稀释液各取100 µL滴加到含有3% NaCl的LB琼脂培养基的培养皿中，进行涂布。
      注意： 使用海水琼脂（MA）作为替代培养基。为获得可靠结果，每种稀释度需设三个重复。
   3. 将培养皿在目标温度（如 26 °C）下孵育 1−3 天。每天检查一次培养皿。
   4. 使用划线平板法在新平板上选择并分离具有明显不同生长形态的菌落。根据需要重复此步骤，直至平板上获得纯菌落。
   5. 如果未立即继续进行步骤 2.3.1，则按照第 2.2 节所述，将分离物储存于 4 °C 或甘油中。
2. 制备甘油菌种保存液。
   注意： 此步骤为可选步骤，可用于细菌长期保存。
   1. 从新鲜平板或4 °C保存的平板上挑取单菌落，分别接种于2 mL无菌LB培养基中。
   2. 将试管置于恒定振荡条件下（150 × g在24−28 °C下过夜（ON）培养。
   3. 从步骤2.2.2中取1 mL细菌培养物，加入无菌甘油至终浓度为20%，混匀后转移至2 mL冻存管中。
   4. 将冻存管置于4 °C，保持原状。
   5. 将甘油菌种保存于 -80 °C，待用。
3. 进行雌二醇（EE2）降解能力测试。
   1. 在LB肉汤或替代培养基中活化分离株。为此，从新鲜平板或4 °C保存的平板上挑取单个菌落，接种于2 mL无菌LB培养基中。若为甘油保存菌种，需先在LB琼脂平板上划线，于24−28 °C过夜培养以获得单菌落。将含有LB培养基的试管置于恒定振荡条件下（150 x）倾斜放置 g在 24−28 °C 下过夜培养。
   2. 细菌培养完成后，以8,000 x g离心收集细胞沉淀。 g 室温（RT）孵育8分钟。弃去上清液，用移液器轻柔吹打，加入等体积（2 mL）生理盐水重悬细胞，以洗涤残留的LB肉汤。
   3. 重复步骤2.3.2两次，以确保无碳源残留，每次均用等体积的生理盐水重悬细胞。例如，若起始培养物体积为2 mL，则最终用2 mL生理盐水重悬细胞。
   4. 将洗涤并重悬的细胞接种于以EE2为唯一碳源的最低量布什内尔-哈斯培养基（BH肉汤）中。
      注意： EE2 以乙醇为溶剂溶解，于培养基中的终浓度为 5 mg/L。根据需要更换污染物种类和/或调整其浓度。
   5. 通过在LB琼脂培养基上测定600 nm处的光密度和/或菌落形成单位（CFU），评估细菌在培养16−72小时内的生长情况。
      注意： 或者，可直接在以雌酮二乙酯（EE2）或其他化合物作为唯一碳源的最低培养基上分离微生物。该步骤可实现定向筛选，并避免非目标微生物的生长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
500 mL PYREX 培养基储存瓶	thomas scientific/Corning	1743E20/1395-500	用于采集水样。
500 mL 抽滤瓶	thomas scientific/Corning	1234B28/1220-2X	用于分离油相组分。
6 英寸钢丝钳	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	用于切割珊瑚片段。
17a-乙炔雌二醇	LGC Standards	DRE-C13245100	用作唯一碳源以制备选择性培养基。
琼脂	Himedia	PCT0901-1KG	用于制备固体培养基。
Bushnell Haas 肉汤	Himedia	M350-500G	用作基础培养基，需添加碳源进行补充。
锥形瓶	thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)	4882H35/26500-125	用于将珊瑚匀浆与玻璃珠共同孵育。
LB 肉汤，Miller 型（Miller Luria Bertani 肉汤）	Himedia	M1245-1KG	用作富集培养基以培养细菌。
2216 海水琼脂（Zobell 海水琼脂）	Himedia	M384-500G	用作富集培养基以培养细菌。
摇床培养箱			用于孵育液体培养基和油相样品。
平板培养箱			用于孵育平板。
瓷制研钵和研杵	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	用于研磨珊瑚片段以制备匀浆。
Qubit 2.0 荧光计	Invitrogen		用于 DNA 和 PCR 产物的核酸定量。
冷冻离心机			用于离心细菌培养物。
分光光度计			用于测定细菌培养物的光密度。