海水样品中石油降解海洋细菌的选择性富集与分离

摘要

来源：Villela, H. D. M.，等．用于共生体研究与保护的生物修复与益生菌开发中的微生物菌株筛选．J. Vis. Exp. （2019）

本视频展示了通过在以油为基础的培养基上富集海水样品，选择性分离海洋石油降解细菌的方法，从而获得可用于原油生物修复和环境清理的纯菌株。

方案

1. 用于微生物分离的海水与珊瑚采集及保存

注意： 必须记录采样点的坐标和温度。如果可能，盐度、pH、深度和光照强度等元数据也有助于优化培养方法并对后续数据进行解释。为获得可靠结果，应尽可能缩短样品的保存时间。如果样品未在适宜温度下保存和/或长期储存，水体/珊瑚微生物组可能会发生显著变化。若无法在采集后立即进行分离操作，则必须将样品在 4 °C 条件下保存直至处理。即使在 4 °C 下，保存时间越长，微生物群落的变化也越大。

1. 采集并储存海水。
   1. 从每个目标采样点至少采集三份500 mL的水样。建议使用带螺旋盖的无菌瓶。
   2. 若在采集后立即处理水样，可将瓶子在室温（RT）下短暂存放；若延迟处理，则应将瓶子保存在4 °C条件下。
2. 采集并储存珊瑚样本。
   1. 使用无菌镊子从与水样相同的采样点剪取珊瑚片段。为避免污染，仅可通过无菌手套接触珊瑚。
   2. 用20 mL无菌生理盐水（3% NaCl（氯化钠）溶于蒸馏水中）或人工海水冲洗所采集的珊瑚片段，以去除附着不牢的海水自由生活细菌。
   3. 使用镊子将每块珊瑚片段放入含有无菌生理盐水、带螺旋盖的无菌250−500 mL容器中。
   4. 在实验室中，使用无菌镊子和钳子，将5 g珊瑚片段置于无菌100 mm x 20 mm培养皿中，并用天平称重。
   5. 将5 g珊瑚样品转移至无菌研钵中，使用无菌研杵进行研磨。
   6. 使用无菌刮铲将研磨后的样品转移至含有45 mL 3% NaCl无菌溶液和10−15颗5 mm玻璃珠的无菌培养瓶中。可使用部分45 mL无菌生理盐水冲洗研钵，以最大限度回收研磨物。
   7. 将培养瓶置于恒定振荡条件下（150 × g），在采样点水温下振荡16小时。
      注意： 对于浅水珊瑚，最适温度范围为24−28 °C。此步骤可使附着于珊瑚不同组分（如宿主细胞表面、组织内部或骨骼内）的微生物脱落。完成此步骤后，珊瑚研磨液不应储存，须立即进行分离步骤。

2. 从海水和/或珊瑚中分离石油降解细菌

1. 制备一种以原油水溶性组分（oWSF）和原油水不溶性组分（oWIF）作为唯一碳源的最低培养基。
   1. 将1−2%的原油加入500 mL无菌蒸馏水中。使用底部可开启的滤瓶，在不扰动上层不溶性组分的情况下分离出可溶性组分。
   2. 将混合物在24−28 °C、150 × g 条件下持续振荡48小时。
   3. 将含有原油各组分的滤瓶置于稳定平面上，静置10−20分钟，使可溶性与不溶性组分充分分离。
   4. 将oWSF转移至新的无菌烧瓶中，并通过打开滤瓶底部移出可溶性组分，从而保留oWIF。
   5. 利用上一步回收的全部oWSF（约400 mL），配制1 L以oWSF为唯一碳源的BH（Bushnell Haas）琼脂最低培养基。
   6. 利用步骤2.1.4中烧瓶内剩余的oWIF，配制1 L以oWIF为唯一碳源的BH琼脂最低培养基。
2. 分离能够降解oWSF和oWIF的细菌。
   1. 分别取步骤1.1.2中的水样和步骤1.2.7中的珊瑚匀浆液，用无菌生理盐水进行梯度稀释至10^-6，方法如下。
3. 对珊瑚样品在无菌生理盐水中进行连续稀释至10^-9，对水样则稀释至10^-6。每次移液前将吸头上下吹打5次，弃去吸头前需充分混匀；每次进行下一级连续稀释前，均需将样品涡旋振荡5秒。
4. 取每种稀释液各100 µL，分别接种于含有BH-oWSF和BH-oWIF琼脂培养基的培养皿中，进行涂布。
5. 将培养皿在目标温度（例如26 °C）下培养1−3天，每天观察一次培养情况。
6. 采用划线分离法，在新培养皿上挑选并分离具有不同生长形态的菌落。根据需要重复此步骤，直至获得纯培养菌落。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
500 mL PYREX 培养基储存瓶	thomas scientific/Corning	1743E20/1395-500	用于采集水样。
500 mL 抽滤瓶	thomas scientific/Corning	1234B28/1220-2X	用于分离油相组分。
6 英寸钢丝钳	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	用于切割珊瑚片段。
琼脂	Himedia	PCT0901-1KG	用于制备固体培养基。
Bushnell Haas 肉汤	Himedia	M350-500G	用作基础培养基，需添加碳源进行补充。
锥形瓶	thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)	4882H35/26500-125	用于在玻璃珠存在下孵育珊瑚匀浆。
超净工作台			需要在无菌条件下操作。
LB 肉汤，Miller 型（Miller Luria Bertani 肉汤）	Himedia	M1245-1KG	用作营养丰富的培养基以培养细菌。
海水琼脂 2216（Zobell 海水琼脂）	Himedia	M384-500G	用作营养丰富的培养基以培养细菌。
摇床培养箱			用于孵育液体培养基和油样。
平板培养箱			用于孵育平板。
瓷制研钵和研杵	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	用于研磨珊瑚片段。
冷冻离心机			用于离心细菌培养物。
分光光度计			用于测定细菌培养物的光密度。
Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒	Promega	A1120	用于微生物菌株的 DNA 提取。