在微流控系统中以单细胞分辨率追踪细菌生长

摘要

来源： Cabeen, M. T., 等单细胞微流控分析 芽孢杆菌属 subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了利用微流控装置在单细胞水平上观察细菌生长的过程。视频中呈现了非运动性细菌细胞被限制在微米级沟槽内，在荧光显微镜下持续获得营养并进行成像。该系统可实现对细胞分裂及多代谱系追踪的实时可视化。

方案

1. PDMS 装置浇铸

1. 在无尘环境中，按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物与固化剂，并在真空条件下脱气至少10分钟。
2. 将硅模板（或其环氧树脂或聚氨酯复制品）放置于聚苯乙烯培养皿中一张完整的铝箔上。将脱气后的PDMS混合物倒入模板上，厚度约为5 mm。将培养皿再次置于真空环境中脱气至少10分钟。使用轻微的气流吹破表面气泡。
   注意：塑料复制模板在脱气过程中可能部分漂浮；若发生此情况，可用洁净的塑料涂布棒轻轻压住复制品。
3. 在60 °C的烘箱中固化PDMS至少1小时，随后冷却至室温。将带有模板和已固化PDMS的铝箔从培养皿中取出。小心地从模板背面剥离铝箔，再小心地将PDMS从模板上剥离。
   注意：也可选择在室温下过夜固化PDMS。为克服硅片模板相对易碎的问题，可使用环氧胶将硅片永久粘合至一个厚度为1/16英寸、尺寸相同的铝盘上。
4. 由于一个硅片通常包含多个尺寸略有不同的微流控装置，应使用洁净锋利的手术刀切割出所需尺寸的单个装置。
   注意：常规进行枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）实验时，应选用细胞沟道宽度为1.0 µm的装置。

2. 装置冲孔与键合

1. 将一片半透明办公胶带（参见材料表）覆盖在装置的图案面，以增强图案特征的可见性。进样口和出样口位于可见流体通道两端的....

结果

图1：微流控装置示意图。 图示为按近似比例绘制的装置示意图。字母标识符与用于连接平头针的进样口和出样口区域均标出。通常仅使用一半的图案化通道（灰色阴影部分）。细胞沟槽朝向标识符方向排列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
道康宁 Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning	(240)4019862	在本实验方案中简称为 PDMS。包含两种组分，按 10:1 的比例混合
0.75 mm 活检打孔器	World Precision Instruments	504529
22 × 40 mm，1.5 号盖玻片	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50 等离子刻蚀仪	Plasma Etch Inc.	PE-50	用于通过氧气等离子体处理将 PDMS 键合至玻璃
Tygon 柔性管，内径 0.02 英寸，外径 0.06 英寸	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	用于管路主体部分，例如连接针头
硅胶管，内径 0.04 英寸，外径 0.085 英寸	HelixMark 标准硅胶管	60-795-05	用于夹管阀和 Y 型接头连接
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-100G	用作钝化剂
ART 凝胶吸头（P200）	Molecular BioProducts	2155	用于向装置中加入培养基和细胞
Acrodisc 32 mm 注射式滤器，带 5 μm Supor 膜	Pall Life Sciences	4560	用于在加载装置前过滤培养物
21 号钝头针，1 英寸	McMaster-Carr	75165A681
Y 型连接器，带 200 系列接头，内径 1/16 英寸管路，聚丙烯材质	Nordson Medical	Y210-6005	该公司亦称 Value Plastics
Eclipse Ti-E 倒置显微镜	Nikon		该型号已被制造商停产，由 Ti2-E 取代
LB Lennox 培养基	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18 微型离心机	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis 菌株 NCIB3610	Bacillus 遗传资源中心	3A1	野生型亲本菌株，经改造后用于本实验方案所示实验
重力对流烘箱	VWR	414005-106	用于固化 PDMS 及烘烤组装完成的装置
Scotch-Weld 环氧树脂试剂盒	3M	2216 B/A	可用于将硅片键合至铝制背板
Scotch Magic 透明胶带，3/4 英寸宽	3M		用于清除 PDMS 装置上的灰尘，或覆盖在结构上以增强可见性（在实验方案中记为“办公用胶带”或“粘性胶带”）
体视显微镜	Nikon	SMZ800N	此处仅作示例；几乎任何体视显微镜均可使用
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907	用于清洁盖玻片
六通道注射泵	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes 无尘擦拭纸	Kimberly-Clark	34120	一种无尘擦拭纸品牌