在微流控系统中以单细胞分辨率追踪细菌生长

摘要

来源： Cabeen, M. T., 等单细胞微流控分析 芽孢杆菌属 subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了利用微流控装置在单细胞水平上观察细菌生长的过程。视频中呈现了非运动性细菌细胞被限制在微米级沟槽内，在荧光显微镜下持续获得营养并进行成像。该系统可实现对细胞分裂及多代谱系追踪的实时可视化。

方案

1. PDMS 装置浇铸

1. 在无尘环境中，按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物与固化剂，并在真空条件下脱气至少10分钟。
2. 将硅模板（或其环氧树脂或聚氨酯复制品）放置于聚苯乙烯培养皿中一张完整的铝箔上。将脱气后的PDMS混合物倒入模板上，厚度约为5 mm。将培养皿再次置于真空环境中脱气至少10分钟。使用轻微的气流吹破表面气泡。
   注意：塑料复制模板在脱气过程中可能部分漂浮；若发生此情况，可用洁净的塑料涂布棒轻轻压住复制品。
3. 在60 °C的烘箱中固化PDMS至少1小时，随后冷却至室温。将带有模板和已固化PDMS的铝箔从培养皿中取出。小心地从模板背面剥离铝箔，再小心地将PDMS从模板上剥离。
   注意：也可选择在室温下过夜固化PDMS。为克服硅片模板相对易碎的问题，可使用环氧胶将硅片永久粘合至一个厚度为1/16英寸、尺寸相同的铝盘上。
4. 由于一个硅片通常包含多个尺寸略有不同的微流控装置，应使用洁净锋利的手术刀切割出所需尺寸的单个装置。
   注意：常规进行枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）实验时，应选用细胞沟道宽度为1.0 µm的装置。

2. 装置冲孔与键合

1. 将一片半透明办公胶带（参见材料表）覆盖在装置的图案面，以增强图案特征的可见性。进样口和出样口位于可见流体通道两端的圆形区域（图1）。为在装置上打孔以安装进样和出样针时提高其可见性，可使用细头记号笔在进样口和出样口位置标记圆点。
   注意：为确保进样和出样针之间不拥挤，从设备字母标识正下方的通道开始，每隔一个通道打一个孔。
2. 翻转PDMS装置，使图案面朝下，使用0.75 mm的活检打孔器对准已标记的点进行打孔；丢弃打下的PDMS碎片。
   注意：将装置图案面朝下打孔的原因是，活检打孔器在进入聚合物时通常会在入口处产生轻微的喇叭形孔。以倒置方向打孔可确保图案面上的孔具有清晰锐利的边缘。
3. 使用体视显微镜检查打孔位置，确保孔与装置的进样口和出样口区域重合。使用细头镊子清除打孔处残留的任何多余PDMS碎片。
4. 使用胶带清除装置两面的灰尘，并将其放入洁净的聚苯乙烯培养皿中。取一块22 mm × 40 mm的盖玻片，用100%异丙醇润湿后，用无尘布擦拭；再用无尘空气或氮气流吹干。
5. 将打孔后的PDMS装置（图案面朝上）与清洁后的盖玻片一同放入氧气等离子体清洗机中。
   1. 采用以下参数进行等离子体处理：真空度70 mTorr；O₂压力200 mTorr；处理时间15 s；功率30 W。等离子体处理结束后立即取出装置和盖玻片。
   2. 将PDMS装置翻转，使其图案面朝下，置于盖玻片中心，确保图案面与玻璃接触；调整位置，使进样口与出样口之间的供液通道与盖玻片的长轴对齐。轻轻按压，确保PDMS与玻璃之间密封良好。
6. 将组装好的装置在60 °C烘箱中烘烤至少1小时。烘烤后，轻轻按压装置一角，手动检查PDMS是否已牢固键合至玻璃。
   注意：装置键合完成后应在24小时内使用，因为随着时间推移，聚合物在等离子体处理后会逐渐恢复疏水性。

3. 微流控管路准备

1. 将聚合物管（内径（ID）0.02 英寸，外径（OD）0.06 英寸）切成适当长度，使其能够从注射泵连接至切换装置（若使用）以及安装在显微镜上的器件。根据微流控通道的数量，切割相应数量的管段。
2. 组装用于夹管阀的Y型接头（若使用）：将2厘米长的柔性硅胶管（内径0.03英寸，外径0.065英寸）连接至“Y”形接头上方两个凸起接口，将1厘米长的硅胶管连接至“Y”形接头下方单个凸起接口。
3. 剪取10厘米（或适当长度）的聚合物管；将一端插入“Y”形接头底部接头上的1厘米长硅胶管段，连接至切换接头。另一端连接已从塑料注射器接头拆下并在距针尖约9毫米处弯成约90°的21G针头。
4. 将21G钝头针插入管路的一端，连接至从注射器通向切换装置的管路段；将每段管路的另一端插入Y型接头进样锥上的硅胶管段内。
   注意： 使用某种装置来固定夹管阀和连接处；该装置可轻松用移液器吸头盒制作图 2D).
5. 将聚合物管剪成适当长度，用于将装置出口的废液导入废液杯中。将管的一端连接至上述方法制备的弯头21-G针头，另一端用胶带固定在废液杯内。
6. 配制适量体积的培养基，其中含0.1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），并填充至所需规格和数量的注射器中。将装有BSA的注射器连接至已安装在进液管路上的21G针头，并将注射器装入注射泵中。
   注意： 典型实验中使用该设备的5个通道，每个通道配有一个20 mL注射器。当实验涉及培养基更换时，需要两组注射器，每组各5个。其中，装有第一组注射器（含更换前培养基）的泵称为第一阶段泵，装有第二组注射器（含更换后培养基）的泵称为第二阶段泵。
7. 通过以高流速运行注射泵，从入口管路中排出空气（>500 µL/min），首先将注射泵垂直放置，并轻敲注射器以使气泡上升至顶部。待注射器中的空气排尽后，将注射泵水平放置，并从注射器开始沿聚合物管路逐步轻敲或弹击，经切换装置向上排出气泡。若需更换培养基，则对第二组注射器重复上述操作。
8. 在排除气泡后，设置第二相注射泵（即，将用于第二阶段（切换后使用）的培养基流速调整为1.5 µL/min，然后暂停流动。在Y型接头分支中对应第二培养基相的柔性管段上夹上小型文件夹夹子。继续以适中的流速运行第一相注射泵（例如以10 µL/min的流速持续灌注至少30分钟，以清除Y型接头下游进样管路中的第二种培养基。

4. 细胞培养准备

1. 在所需的培养基中过夜培养目标菌株，使其进入稳定期。所用细菌菌株应携带一种使细胞失去运动能力的突变，以防止细胞游出装置的通道。
   注意：本实验方案中使用的菌株为 B. subtilis 3610，携带 hagA233V 突变（该突变使鞭毛呈直线状而非螺旋状，从而阻止细胞运动），并含有 PrsbV-mNeonGreen 报告系统用于检测细胞应激，以及组成型表达的 Phyperspank-mNeptune（红色）报告系统以标记细胞。示例实验中使用的是Luria-Bertani（LB）Lennox培养基。微流控实验常用的菌株通常包含一个或多个荧光转录报告系统，以及一种组成型表达的胞质荧光蛋白，以便实现细胞的自动识别。使用LB Lennox富集培养基时未观察到生长缺陷，但在微流控条件下，B. subtilis 在最低培养基中的生长可能受到抑制，原因是分泌的铁载体被培养基流动冲走。在此类情况下，可参考S750培养基的配方，通过向培养基中添加柠檬酸钠和三氯化铁来恢复其生长。
2. 实验当天早晨，将 B. subtilis 细胞按1:50比例稀释至含有25 mL培养基的带挡板250 mL三角瓶中。在37 °C条件下振荡培养5–6小时，使细胞光密度达到1以上。
   注意：高密度细胞培养更理想，因为处于稳定期的 B. subtilis 细胞体积较小，且较少形成细胞链，有利于装置的加载。不同细菌种类可能需要不同的培养基或生长条件以实现最佳加载效果。
3. 使用装有孔径为5 µm滤膜的注射器，将约15 mL细胞培养物过滤至15 mL锥形管中，以去除 B. subtilis 细胞链（此步骤对 E. coli 无需进行，其他菌种也可能不需要）。
   注意：应尽量减少细胞损失；滤液应保持浑浊。
4. 将过滤后的培养物在室温下以4,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并用管内残留的少量上清液重悬细胞沉淀，必要时可加入约500 µL新鲜培养基，以便于移液操作。

5. 设备装载

1. 将空的薄胶加样微量移液器吸头（参见材料表）轻轻插入微流控装置的出口孔中。
2. 使用薄胶加样吸头和P200微量移液器，向入口孔中注入含有1 mg/mL BSA的培养基以钝化装置，同时观察出口孔中的吸头，以监测微流控通道的填充情况（图2A）。在室温下孵育装置约5分钟。
   注意：BSA通常用作封闭或钝化试剂，可结合PDMS聚合物的疏水表面，增加其亲水性，并减少其他蛋白质或细胞（通过细胞表面分子）的非特异性结合。
3. 使用薄胶加样吸头，将重悬细胞（来自第4节）加入每个通道，利用出口通道中的吸头监测细胞在装置中的流动过程（图2B）。
   注意：为便于加样，可将P200微量移液器调至最大200 µL体积，先吸取一段空气垫，再吸取少量细胞（约等于吸头细端部分体积的一半）。由于PDMS装置的体积相对于移液器较小，因此重悬细胞的体积无需精确。只要细胞悬液能够顺利移入装置，目前尚无观察到重悬细胞密度的上限。细胞团块可能堵塞装置，应通过充分吹打或涡旋混匀避免。
4. 逐一小心地从出口孔中移除胶加样吸头，每次操作一个，以防止损坏装置。
5. 将装置放入台式微量离心机中，使用合适的转子适配器，以约6,000 × g离心10分钟（图2C）。
   注意：本实验使用了定制加工的铝制转子适配器，专为适配微量离心机转子而设计（图2C）；不同型号的离心机可配合相应的转子适配器使用。适配器的关键特性在于其能提供朝向细胞沟槽封闭端方向的侧向力，从而推动细胞进入侧通道。
6. 在显微镜下检查加样是否成功（图3），但此时不要将装置固定在载物台支架/插片上。
   注意：在本方案中，使用60X、1.4 NA Ph3油镜物镜进行此阶段的验证以及后续成像。

6. 装置组装、平衡与安装

1. 小心地将已加载的装置固定到载物台插件上，方法是用胶带将PDMS两侧的盖玻片固定在载物台插件底部（即，连接装置前先将载物台插件翻转）。将载物台插件与装置的组装体翻转，使PDMS面朝上，置于柔软表面（如无尘擦拭布）上图 2D).
2. 将相1注射泵的流速调节至35 µL/min。每次操作一个通道，先插入进样针，再插入出样针。即，流至废液烧杯； 图2E).
3. 用洁净无尘的擦拭布擦去多余的培养基，并目视检查装置是否泄漏。观察出口管路中是否有过多细胞（通常呈现为浑浊条带）以及培养基的弯月面，后者将缓慢移向废液烧杯。
4. 让装置以35 µL/min的速度运行约15至30分钟，直至所有连接的通道均流入废液杯中。
5. 将第一相注射泵设置为1.5 µL/min并暂停流速。将整个泵和装置系统转移至显微镜处（此过程可通过将其放置于带轮推车上辅助完成），然后以1.5 µL/min重新启动第一相培养基的流动。小心地将装有装置的载物台插入件安装到倒置荧光显微镜上，必要时使用胶带固定进样和出样管路。
6. 在设备上定位所需成像位置，并按需开始成像。需注意，细胞通常需要数小时（约10个世代）才能达到稳定指数生长期，可根据需要延迟图像采集的开始时间，以确保成像在平衡期结束后进行。
   注意： 在后续图像分析中，应通过追踪细胞分裂时间并确保其已达到恒定的最小值，来验证处于指数生长期的细胞是否实现了稳态生长。

结果

图1：微流控装置示意图。 图示为按近似比例绘制的装置示意图。字母标识符与用于连接平头针的进样口和出样口区域均标出。通常仅使用一半的图案化通道（灰色阴影部分）。细胞沟槽朝向标识符方向排列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
道康宁 Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning	(240)4019862	在本实验方案中简称为 PDMS。包含两种组分，按 10:1 的比例混合
0.75 mm 活检打孔器	World Precision Instruments	504529
22 × 40 mm，1.5 号盖玻片	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50 等离子刻蚀仪	Plasma Etch Inc.	PE-50	用于通过氧气等离子体处理将 PDMS 键合至玻璃
Tygon 柔性管，内径 0.02 英寸，外径 0.06 英寸	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	用于管路主体部分，例如连接针头
硅胶管，内径 0.04 英寸，外径 0.085 英寸	HelixMark 标准硅胶管	60-795-05	用于夹管阀和 Y 型接头连接
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-100G	用作钝化剂
ART 凝胶吸头（P200）	Molecular BioProducts	2155	用于向装置中加入培养基和细胞
Acrodisc 32 mm 注射式滤器，带 5 μm Supor 膜	Pall Life Sciences	4560	用于在加载装置前过滤培养物
21 号钝头针，1 英寸	McMaster-Carr	75165A681
Y 型连接器，带 200 系列接头，内径 1/16 英寸管路，聚丙烯材质	Nordson Medical	Y210-6005	该公司亦称 Value Plastics
Eclipse Ti-E 倒置显微镜	Nikon		该型号已被制造商停产，由 Ti2-E 取代
LB Lennox 培养基	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18 微型离心机	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis 菌株 NCIB3610	Bacillus 遗传资源中心	3A1	野生型亲本菌株，经改造后用于本实验方案所示实验
重力对流烘箱	VWR	414005-106	用于固化 PDMS 及烘烤组装完成的装置
Scotch-Weld 环氧树脂试剂盒	3M	2216 B/A	可用于将硅片键合至铝制背板
Scotch Magic 透明胶带，3/4 英寸宽	3M		用于清除 PDMS 装置上的灰尘，或覆盖在结构上以增强可见性（在实验方案中记为“办公用胶带”或“粘性胶带”）
体视显微镜	Nikon	SMZ800N	此处仅作示例；几乎任何体视显微镜均可使用
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907	用于清洁盖玻片
六通道注射泵	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes 无尘擦拭纸	Kimberly-Clark	34120	一种无尘擦拭纸品牌