利用微流控装置评估细菌运动性

摘要

来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了使用微流控装置，通过由随机排列的微柱构成的多孔基质来定量细菌的运动能力。将荧光标记的细菌引入装置，在显微镜下观察其穿过多孔基质进入观测通道的运动过程，并进行分析以生成穿透曲线（BTC）。

方案

1. 细菌培养条件

1. 在超净工作台内操作，取100 μL绿色荧光蛋白（GFP）标记的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440甘油菌种（浓度为1 × 10⁷ mL^-1，保存于-80 °C），接种至5 mL LB（Luria-Bertani）培养基中。于30 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。
2. 次日，取100 μL过夜培养物重悬于5 mL LB培养基中，在相同条件下继续培养5小时（对数生长期）。取1 mL培养液转移至2 mL离心管中，静置冷却至室温（约15分钟），然后离心（2300 × g，5分钟）。
3. 弃上清液，向菌体沉淀中加入1 mL运动缓冲液，短暂涡旋振荡以混匀样品。根据需要稀释至目标细胞浓度，例如5 × 10⁵ mL^-1。
4. 对于涉及天然群落（如来自溪流的微生物群落）的实验，需制备非选择性培养基。例如，可使用经无菌过滤并高压灭菌的溪水，或添加复杂碳源（如LB培养基）的人工溪水培养基。

2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置的制备

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计所需的多孔几何结构，该结构由一系列圆形矩阵（即对流动不透的障碍物）组成，以半径尺寸和圆心坐标来描述。
   注意：图1A

结果

图1：用于研究多孔介质中微生物迁移的微流控装置 （A）由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）铣削而成的微流控装置示意图。多孔基质被铣刻在装置的底层，顶部盖板通过螺丝密封。截面图显示了微流控装置内柱状结构的排列方式。插图展示了一个具有规则排列柱状结构的多孔基质及其相应的流速场分布。（B）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置固定在显微镜玻.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma
弹性体 Sylgard 184	Dowsil	101697
NovoCyte 流式细胞仪	Acea
葡萄糖	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB（Luria-Bertani）肉汤	BD
液体分配器，XY 绘图机器人套件	makeblock
Axio Imager 显微镜	Zeiss
AxioZoom v16 显微镜	Zeiss
显微镜载玻片，75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 蠕动泵	Gilson
等离子体键合仪 Corona SB	BlackHole Lab
磷酸钾	Sigma
New Era NE 4000 注射泵	New Era
Syto 13 绿色荧光核酸染料	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon 管路	Ismatec
WF31SA 通用铣床	Mikron