使用微流控装置评估细菌运动能力

Abstract

资料来源： Scheidweiler， D. 等人。 结合流体装置与显微镜和流式细胞术，研究跨空间尺度的多孔介质微生物运输。 J. Vis. Exp.（2020年）。

本视频演示了利用微流控装置通过由随机排列的柱子组成的多孔基质来量化细菌的运动能力。将荧光标记的细菌引入设备，通过显微镜成像它们穿过多孔基质进入观察通道，并分析以生成突破曲线（BTC）。

Protocol

1. 细菌培养条件

1. 在层流罩下工作，使用100微升绿色荧光蛋白（GFP）标记的假 单胞 菌KT2440甘油库存（1 ×^{10 7 mL-1}，储存于-80°C）接种5毫升Luria-Bertani（LB）培养基。在30°C下孵育，同时以250转/分钟摇晃，过夜。
2. 第二天，将100微升过夜培养液重新悬浮于5毫升磅培养基中，并在相同条件下培养5小时（指数相）。将1毫升分量样品放入2毫升管中，冷却至室温（~15分钟），然后离心（2300 x g，5 分钟）。
3. 去除上清液，向沉淀中加入1毫升的运动缓冲液。短暂地用漩涡均匀化样品。稀释至所需细胞浓度，例如5 x 10^{5 mL-1}。
4. 对于涉及自然群落的实验，如源自溪流的，则准备非选择性培养基。例如，可以使用经过无菌过滤和高压灭菌处理的溪流水，或添加复杂碳源（LB介质）的人工溪流水介质。

2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控器件的制备

1. 通过计算机辅助绘图（CAD）软件设计所需的多孔几何形状，该软件由一个圆矩阵组成（即不透水的流动障碍），通过半径大小和中心坐标描述。
   注： 图1A中提供了一个具有随机晶粒和孔径的多孔几何示例。靠近出口的无障碍观测通道便于获取突破曲线（BTCs）。
2. 根据所选几何形状，使用标准SU-8光刻制备模具。
   注意：或者，也可以从专门的微制造工厂订购模具。为了获得水平面上的异质流体流动，设计微流控腔的厚度与平均孔喉大小相当数量级非常重要。但要确保微流控设备的尺寸适合显微镜下观察（例如，用于显微镜载玻片的工作）。
3. 用无针注射器将10%的交联剂（二甲基、甲基氢硅氧烷共聚物）加入90%的弹性体中，制备50克PDMS。在清洁条件下工作，尽量避免灰尘。将两种试剂混合在一个干净的一次性容器中，施加真空（100毫巴）30分钟，以去除粘稠PDMS中的溶解空气和气泡。
4. 将模具放入培养皿（直径100毫米，高15毫米）。将PDMS倒入模具上，达到所需高度（例如2-5毫米）。盖上培养皿，保持60°C4小时（厚层则过夜）以固化。
   注意：为了可视化目的，光应能够通过PDMS;因此，希望薄层厚度在2毫米到5毫米之间。较厚的层（>5毫米）会降低器件的透明度，而较薄的层在应用过程中会发生变形。
5. 将模具从烤箱取出，让微流控装置冷却至室温。冷却后，用手术刀小心取出所需部分的PDMS。
   注意：对模具施加强力压力会导致模具破裂。不要用手触摸PDMS，因为指纹会影响光学透明度。
6. 用胶带暂时封住PDMS通道底部（刻有所需几何形状的地方）。使用直径0.5毫米的活检穿孔器，穿透微流控通道，形成一个入口和一个出口，并配合0.5毫米（内径）管路。
   注意：PDMS的柔软特性确保插入管路时保持紧固。PDMS密封于玻璃后，无法再建入出口通道。
7. 通过高频发生器（等离子体结合器，材料 表）通过氧等离子体键合封闭微流控通道。为此，用乙醇清洗硅酸盐玻璃片（25毫米×75毫米）并晾干。将磁带从PDMS通道中取出，将通道朝上放置，使孔隙面朝上。在室温下用等离子体处理硅酸盐玻璃载玻片和PDMS表面约45秒。
8. 将PDMS通道放置在硅酸盐玻璃载玻片上，在热板上以100°C加热30分钟。
9. 将微流控装置从热板上取下，冷却至室温。用管子连接PDMS通道入口。用真空30分钟去除PDMS中的空气，PDMS几乎不透流体但对气体有渗透性。
10. 准备100毫升动力缓冲液（10 mM磷酸钾，0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），补充1% w/v葡萄糖，pH值7.0），并用注射器泵（10 μL ^min-1）将1毫升注入微流控装置。
    注意：由于之前的真空步骤导致PDMS气体不足，气泡将在~30分钟内消失。

3. 利用PDMS微流控器件分析细菌运输

1. 将先前浸有运动缓冲剂的PDMS微流控装置放置在显微镜台上。用胶带固定管子，以减少舞台移动时对水流的干扰。
2. 将显微镜台移到靠近输出的观察通道。利用明场显微镜或相位对比，聚焦观察通道中心，并调整放大倍率以显示单个细菌细胞。
3. 将光路设置切换到荧光显微镜，并调整相机曝光时间以分辨单个细菌细胞（例如100毫秒），或者使细胞的荧光信号至少是背景噪声的3倍。
4. 接着，将入口管插入装有细菌悬浮液的2毫升管中。反向泵，以1微升min-1的流量开始抽取悬浮液。
5. 扫描整个观测通道的横截面，每2分钟录制一张复合图像，贯穿整个实验期间。

Results

图1：用于研究多孔介质中微生物运输的流体装置 （A）由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）铣削的流体装置示意图。多孔基体被铣入设备的底层，并用螺丝关闭盖子。剖面图显示了流体装置内柱子的排列情况。该插入件显示一个多孔基体，具有规律间隔的柱子网格和相应的速度流场。（B）聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置安装在显微镜玻片上。图中分别连接着介质储层和注射器泵的进出流量。显微计数的观察室作为独立腔室，放置在同一显微镜载玻片上，没有多孔基质。插入图显示一个多孔基体，柱子排列随机（直径和间距）。

Materials