利用微流控装置评估细菌运动性

摘要

来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了使用微流控装置，通过由随机排列的微柱构成的多孔基质来定量细菌的运动能力。将荧光标记的细菌引入装置，在显微镜下观察其穿过多孔基质进入观测通道的运动过程，并进行分析以生成穿透曲线（BTC）。

方案

1. 细菌培养条件

1. 在超净工作台内操作，取100 μL绿色荧光蛋白（GFP）标记的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440甘油菌种（浓度为1 × 10⁷ mL^-1，保存于-80 °C），接种至5 mL LB（Luria-Bertani）培养基中。于30 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。
2. 次日，取100 μL过夜培养物重悬于5 mL LB培养基中，在相同条件下继续培养5小时（对数生长期）。取1 mL培养液转移至2 mL离心管中，静置冷却至室温（约15分钟），然后离心（2300 × g，5分钟）。
3. 弃上清液，向菌体沉淀中加入1 mL运动缓冲液，短暂涡旋振荡以混匀样品。根据需要稀释至目标细胞浓度，例如5 × 10⁵ mL^-1。
4. 对于涉及天然群落（如来自溪流的微生物群落）的实验，需制备非选择性培养基。例如，可使用经无菌过滤并高压灭菌的溪水，或添加复杂碳源（如LB培养基）的人工溪水培养基。

2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置的制备

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计所需的多孔几何结构，该结构由一系列圆形矩阵（即对流动不透的障碍物）组成，以半径尺寸和圆心坐标来描述。
   注意：图1A中提供了一个具有随机化颗粒和孔隙尺寸的多孔几何结构示例。在出口附近设置一个无障碍物的观测通道，便于获取穿透曲线（BTCs）。
2. 根据选定的几何结构，采用标准SU-8光刻工艺制备模具。
   注意：也可从专业的微加工机构订购模具。为了在水平面内获得非均质流体流动，微流控腔室的厚度应设计为与平均孔喉尺寸处于同一数量级。但需确保微流控装置的尺寸适合在显微镜下观察（例如，在显微镜载玻片上操作）。
3. 使用无针注射器，按重量比将10%的交联剂（二甲基、甲基氢硅氧烷共聚物）加入90%的弹性体中，配制50 g PDMS。在洁净条件下操作，并尽可能避免灰尘污染。将两种试剂在洁净的一次性容器中混合，并在100 mbar真空条件下脱气30分钟，以去除粘稠PDMS中的溶解空气和气泡。
4. 将模具放入培养皿（直径100 mm，高15 mm）中。将PDMS浇注到模具上至所需高度（例如2–5 mm）。盖上培养皿，在60 °C下固化4小时（较厚层可过夜固化）。
   注意：为便于观察，光应能透过PDMS；因此，建议使用2 mm至5 mm之间的薄层。较厚的层（>5 mm）会降低装置的透明度，而过薄的层在使用过程中易发生形变。
5. 将模具从烘箱中取出，使微流控装置冷却至室温。冷却后，用解剖刀小心切下所需部分的PDMS。
   注意：对模具施加过大的压力会导致模具破裂。请勿用手直接接触PDMS，指纹会影响其光学透明性。
6. 用胶带暂时密封PDMS通道底部（即刻有目标几何结构的一侧）。使用直径为0.5 mm的活检打孔器，在微流控通道上穿孔，形成与0.5 mm（内径）管路匹配的入口和出口。
   注意：PDMS的柔软特性可确保插入管路后实现密封。PDMS与玻璃封接后，无法再加工入口和出口通道。
7. 通过高频发生器（等离子体键合仪，材料表）利用氧等离子体键合技术密封微流控通道。具体操作为：先用乙醇清洗硅酸盐玻璃片（25 mm × 75 mm），并使其自然干燥。去除PDMS通道上的胶带，将通道的多孔面朝上放置。在室温下对硅酸盐玻璃片和PDMS表面进行约45秒的等离子体处理。
8. 将PDMS通道置于硅酸盐玻璃片上，并在加热板上于100 °C加热30分钟。
9. 将微流控装置从加热板上取下并冷却至室温。将PDMS通道的入口与管路连接。施加真空30分钟，以去除PDMS中的空气——PDMS对液体几乎不透，但对气体具有通透性。
10. 配制100 mL运动缓冲液（10 mM磷酸钾，0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），添加1% w/v葡萄糖，pH 7.0），并通过注射泵以10 µL min^-1的流速向微流控装置注入1 mL缓冲液。
    注意：由于PDMS在先前的真空步骤中处于气体欠饱和状态，气泡将在约30分钟内消失。

使用 PDMS 微流控装置分析细菌转运

1. 将先前用运动缓冲液饱和的PDMS微流控装置放置在显微镜载物台上。使用胶带固定管路，以尽量减少载物台移动过程中对流动的干扰。
2. 将显微镜载物台移动至靠近出口的观测通道。使用明场显微镜或相差显微镜，聚焦于观测通道中心，并调整放大倍数以观察单个细菌细胞。
3. 切换至荧光显微镜光路设置，调整相机曝光时间以分辨单个细菌细胞（例如，100 ms），或使细胞的荧光信号强度至少为背景噪声的3倍以上。
4. 接下来，将进样管插入含有细菌悬液的2 mL离心管中。反转泵的运行方向，以1 µL min-1的流速开始吸取悬液。
5. 在整个实验过程中，每隔2分钟对观察通道的整个横截面进行扫描，记录一幅复合图像。

结果

图1：用于研究多孔介质中微生物迁移的微流控装置 （A）由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）铣削而成的微流控装置示意图。多孔基质被铣刻在装置的底层，顶部盖板通过螺丝密封。截面图显示了微流控装置内柱状结构的排列方式。插图展示了一个具有规则排列柱状结构的多孔基质及其相应的流速场分布。（B）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置固定在显微镜玻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma
弹性体 Sylgard 184	Dowsil	101697
NovoCyte 流式细胞仪	Acea
葡萄糖	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB（Luria-Bertani）肉汤	BD
液体分配器，XY 绘图机器人套件	makeblock
Axio Imager 显微镜	Zeiss
AxioZoom v16 显微镜	Zeiss
显微镜载玻片，75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 蠕动泵	Gilson
等离子体键合仪 Corona SB	BlackHole Lab
磷酸钾	Sigma
New Era NE 4000 注射泵	New Era
Syto 13 绿色荧光核酸染料	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon 管路	Ismatec
WF31SA 通用铣床	Mikron