将可诱导基因表达系统转染至表达细菌效应蛋白的细胞中

摘要

来源： 贝伦斯，C. 等 应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰 视频实验杂志 (2015)

本视频演示了利用可诱导表达系统来确定细菌效应蛋白 CaeB 在宿主细胞凋亡级联反应中的干扰位点。该方法概述了使用四环素响应系统转染表达 CaeB 的细胞，以诱导促凋亡基因的表达，从而识别该级联反应中被阻断的具体环节。

方案

1. 使用可诱导表达载体系统转染稳定细胞系

1. 以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度，将稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）或 GFP-CaeB 的人胚胎肾（HEK）293 细胞接种于 12 孔板中。
2. 接种后 19 小时，用调控质粒和响应质粒共同转染细胞，响应质粒编码 Bax 或活化型 Caspase 3。
   1. 将 100 ng pWHE125-P 调控质粒（图 1）、100 ng 响应质粒 pWHE655-hBax 或 pWHE655-revCasp3（图 2）以及 0.4 µl 聚乙烯亚胺（polyethylenimine）共同转染稳定的 HEK293 细胞。
   2. 分别将脱氧核糖核酸（DNA）和聚乙烯亚胺转染试剂溶于 75 µl Opti-MEM 培养基中，在室温（RT）下准确孵育 5 分钟。为形成复合物，将两种混合液合并后于室温孵育 15 分钟。
3. 将聚乙烯亚胺/DNA 溶液逐滴加入细胞中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。

2. 诱导细胞凋亡

1. 转染后5小时，向培养基中加入1 µg/ml多西环素，诱导促凋亡蛋白表达。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育18小时。

结果

图1. 调控质粒pWHE125的示意图。 图中显示了在细菌中复制所必需的元件，包括复制起点（ori pBR）和氨苄青霉素抗性盒（Amp^R），以及用于表达Tet-反式调控因子的元件，例如人巨细胞病毒的强组成型早期启动子/增强子（P/E_hCMV

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Life technologies	15140-122
OptiMEM	Life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）	Polyscienes	23966
多西环素（Doxycycline）	Sigma Aldrich	D9891