基因改造细菌细胞中靶酶表达的检测

Abstract

来源： Kim， H. 等， 《利用高通量遗传酶筛选系统进行多酶筛选》。 J. Vis. Exp. （2016）

本视频演示了一种利用宏基因组虫粒文库和染色底物检测酶表达的遗传筛选方法。流式细胞术识别并分离产生有色产物的单细胞，从而实现高通量选择活性酶表达细胞。

Protocol

1. 用遗传酶筛选系统准备宏基因组文库，用于检测对亚硝基酚（pNP）（pNP-GESS）
   1. 利用fosmid库生产套件，利用fosmid载体构建大 肠杆 菌的宏基因组文库。
   2. 在−70°C下储存100微升文库，该库是宏基因组库细胞的来源。
      注意： 在600 nm波长（OD₆₀₀）下测量的样品的光学密度约为100。
   3. 将100微升的现存宏基因组库冰冻解冻，接种于500毫升瓶中，瓶内含50毫升Luria-Bertani（LB）和12.5 μg/ml氯霉素，随后在37°C下培养2小时。
   4. 在50毫升锥形管中，以1000 x g离心，4°C下20分钟采集细胞。
   5. 将颗粒迅速重新悬浮在50毫升冰冷蒸馏水（DW）中，并以1000 x g离心机在4°C下离心20分钟。
   6. 将沉淀液重新悬浮在50微升冰冷的DW中，加入10%（v/v）甘油。使用50微升该电池分量进行电穿孔。
   7. 将50微升电适性细胞和pGESS（E135K） DNA（100ng）混合物放入冰冷电孔玻璃中，并对混合物进行电孔化（1.8 kV/cm，25 μF）。
   8. 迅速加入1毫升超优汤液，加分解物抑制（SOC）培养基，轻柔地将细胞重新悬浮。
   9. 用移液管将细胞转移到14毫升圆底管中，并在37°C下培养1小时。
   10. 将500微升回收的细胞涂抹在一块20 x 20厘米见方的LB平板上，平板内含有12.5 μg/ml氯霉素和50 μg/ml氨苄青霉素。在30°C下孵育平板12小时。
   11. 用细胞刮刀刮取菌落，然后用冰冷的细胞储存介质将细胞收集到50毫升锥形管中。
   12. 在1000 x g下离心20分钟，温度为4°C。将颗粒重新悬浮于10毫升冰冷培养基中，使OD达到₆₀₀ /100。
   13. 将20微升细胞分出，用于在−70°C下储存。
        
2. 从宏基因组库中移除假阳性
   1. 冰冻中含有宏基因组DNA铛粒和pGESS（E135K）的库存宏基因组库细胞（步骤1.13）。
   2. 将10微升细胞接种在2毫升LB中，含50 μg/ml氨苄青霉素和12.5 μg/ml氯霉素，装在14ml圆底管中。在37°C下孵育，摇晃200转/分钟，持续4小时。
   3. 同时，打开荧光激活细胞分选机（FACS）并打开默认的FACS软件。请使用以下设置：喷嘴尖端直径70微米;前向散射面积（FSC-A）灵敏度，300伏对数放大;侧散射面积（SSC-A）灵敏度，350伏对数放大;荧光素异硫氰酸盐面积（FITC-A）灵敏度，450 V对数放大;阈值参数，FSC-A 值 5。
      注意： 材料 表中提到的FACS设备的典型设置。调整其他FACS设备的设置。
   4. 通过将5微升样品加入装有1毫升磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的5毫升圆底管中稀释2.2步的宏基因组文库细胞。
   5. 将稀释后的文库样本放入FACS仪器的加载端口，并点击FACS软件采集仪表盘上的加载按钮。
   6. 通过点击并控制仪表盘上的流量按钮，将事件率调整为每秒1000到1500事件。
   7. 通过点击工具栏中的点图按钮，在全局工作表上创建对数比例FSC-A 与 对数比例SSC-A散点图。用工具栏的多边形门按钮调整散射门R1，以涵盖单重态事件（细菌种群）。
   8. 点击直方图按钮，在工作表上绘制单元格数 与 对数缩放FITC-A的直方图。然后，在检测控制窗口的细胞仪设置标签中调整FITC电压，使钟形分布的峰值小于FITC-A的^10.2 。
   9. 创建一个对数比例的FSC-A ，对比通过点击全局工作表上的点图按钮来绘制对数FITC-A图。在图上使用工具栏上的多边形门按钮设置排序门 R2，使排序门位于分布中心 +5% 到 -5% 单元之间（钟形曲线峰值周围共 10% 单元）。
   10. 在FACS仪器出口放置一个含有1.2 ml LB、含50 μg/ml氨苄青霉素和12.5 μg/ml氯霉素的采集管，分离出10个^6细胞， 同时满足R1和R2门。
   11. 取出收集管和盖子，轻轻地旋转。
        
3. 宏基因组酶筛选
   1. 将分选后的细胞（步骤2.11）在37°C下孵育，以200转/分钟摇晃，直到OD₆₀₀ 达到0.5。
   2. 加入1微升拷贝诱导溶液以放大细胞内的虫粒拷贝数。在37°C下再孵育3小时，摇晃频率为250转/分钟。
   3. 为准备分选细胞，将0.5毫升培养细胞和相应底物（对硝基醋酸酯、对硝基苯β-D纤维苷或苯磷酸盐）加入14毫升圆底管，最终浓度为100微米。
      1. 作为对照样本，将第3.2步培养的0.5毫升细胞加入14毫升圆底管中。在步骤3.3中，将与底物体积相同的PBS加入。
   4. 将两个样品在37°C下孵育，并以200转/分钟摇晃3小时。
   5. 同时，准备FACS机器，配置与第2.3步相同。
   6. 将5微升细胞（用于分选）和对照细胞分别加入两根5毫升圆底管，内含1毫升PBS。
   7. 将装有控制单元的管子放置在FACS的加载口上，并点击FACS软件的获取仪表盘中的加载按钮。通过控制仪表盘上的流量率按钮，将事件速率调整为每秒1000到3000事件。
   8. 通过在软件的全局工作表上点击点图按钮，创建对数比例的FSC-A 与 对数比例的SSC-A散点图，并使用工具栏上的多边形门按钮调整散射门R1以涵盖单重态事件（细菌种群）。
   9. 通过点击工作表上的点图按钮创建对数比例的FSC-A 与 对数比例的FITC-A散点图，并使用工具栏上的多边形门按钮在图上设置排序门R2，使R2门内检测到的负单元格少于0.1%。
   10. 将控制样品管替换为分拣样品管，并通过控制仪表盘上的流量按钮将事件率调整为每秒1000到3000次事件。
   11. 在FACS仪器出口放置一个含有0.5毫升LB的收集管，并分离出10个^4单元， 同时满足R1和R2门。
       注意： 排序标准范围可从R2门FITC-A的前0.1%到5%不等。该方案中，收集了前1%的细胞为阳性。

Materials