检测转基因细菌细胞中靶酶的表达

摘要

来源：Kim, H. et. al., 利用高通量遗传酶筛选系统进行多酶筛选。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用宏基因组fosmid文库和生色底物检测酶表达的遗传筛选方法。通过流式细胞术识别并分离产生有色产物的单个细胞，从而实现对表达活性酶的细胞进行高通量筛选。

方案

1. 利用基因酶筛选系统制备对硝基苯酚（pNP）的宏基因组文库（pNP-GESS）
   1. 构建宏基因组文库 大肠杆菌 使用fosmid文库构建试剂盒，将目标DNA片段克隆至fosmid载体中。
   2. 分装100 µl文库用于在−70 °C保存，作为宏基因组文库细胞的来源。
      注意： 在600 nm波长处测得的样品光密度（OD₆₀₀该文库储备液的浓度约为100。
   3. 将100 µl宏基因组文库储备液置于冰上解冻，接种至含有50 ml LB（Luria-Bertani）培养基和12.5 µg/ml氯霉素的500 ml三角瓶中，于37 °C振荡培养2小时。
   4. 在4 °C、1,000 x g条件下离心20分钟，用50 ml锥形管收集细胞。
   5. 将沉淀物迅速重悬于50 ml预冷的蒸馏水（DW）中，于4 °C、1,000 × g离心20 min。
   6. 将沉淀重悬于50 µl含10%（v/v）甘油的预冷去离子水中。取50 µl该细胞等分试样用于电穿孔。
   7. 将50 µl电转感受态细胞与100 ng pGESS(E135K) DNA的混合物加入预冷的电穿孔杯中，进行电穿孔（1.8 kV/cm，25 µF）。
   8. 迅速加入1 ml SOC培养基（含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤），并轻轻重悬细胞。
   9. 用移液器将细胞转移至14 ml圆底管中，在37 °C下孵育1小时。
   10. 将500 µl回收的细胞涂布于含12.5 µg/ml氯霉素和50 µg/ml氨苄青霉素的LB 20 cm × 20 cm方形平板上。在30 °C下孵育12小时。
   11. 使用细胞刮刀刮取菌落，并用预冷的细胞保存液将细胞收集至50 ml锥形管中。
   12. 在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 20 分钟。将沉淀物重悬于 10 ml 冰冷的细胞保存培养基中，以达到指定的 OD₆₀₀ 100分之
   13. 分装20 µl细胞，于−70 °C保存。
       
2. 去除宏基因组文库中的假阳性结果
   1. 将含有宏基因组DNAfosmid和pGESS(E135K)的宏基因组文库菌株（来自步骤1.13）置于冰上解冻。
   2. 在含有50 µg/ml氨苄青霉素和12.5 µg/ml氯霉素的2 ml LB培养基中，接种10 µl菌液至14 ml圆底管中。37 °C、200 rpm振荡培养4小时。
   3. 同时，打开荧光激活细胞分选仪（FACS）设备并启动默认的 FACS 软件。设置如下参数：喷嘴孔径 70 µm；前向散射光面积（FSC-A）灵敏度 300 V-对数放大；侧向散射光面积（SSC-A）灵敏度 350 V-对数放大；异硫氰酸荧光素面积（FITC-A）灵敏度 450 V-对数放大；阈值参数为 FSC-A 值 5。
      注意： 典型设置参数适用于文中提到的FACS设备 材料列表调整其他流式细胞仪设备的设置。
   4. 将2.2步骤中的宏基因组文库细胞进行稀释，取5 µl样品加入含有1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）的5 ml圆底管中。
   5. 将稀释后的文库样品置于流式细胞仪的加样口，然后点击流式细胞仪软件采集控制面板上的“加载”按钮。
   6. 通过点击并调节仪表板上的流速按钮，将事件速率调整至每秒1,000 - 1,500个事件。
   7. 创建对数-对数缩放的FSC-A 与 在工具栏中点击“点图”按钮，于全局工作表上创建对数缩放的SSC-A散点图。使用工具栏中的“多边形门”按钮调整散射门R1，使其包含单细胞事件（细菌群体）。
   8. 绘制细胞计数直方图 与 通过单击直方图按钮，在工作表上将 FITC-A 设为对数刻度。然后，在检查器控制窗口的细胞仪设置选项卡中调整 FITC 电压，使钟形分布的峰值低于 10² FITC-A的
   9. 创建对数缩放的FSC-A 与在全局工作表上点击“点图”按钮，生成对数FITC-A图。使用工具栏上的“多边形门”按钮在图上设置分选门R2，使该门位于分布中心上下5%细胞范围内（即钟形曲线峰值周围共10%的细胞）。
   10. 在FACS仪器的出口处放置一个收集管，管内含有1.2 ml LB培养基，其中添加50 µg/ml氨苄青霉素和12.5 µg/ml氯霉素，分选10⁶ 同时满足R1和R2门控的细胞。
   11. 取下收集管，盖上盖子，轻轻涡旋震荡。
       
3. 宏基因组酶筛选
   1. 将分选后的细胞（来自步骤 2.11）在 37 °C、200 rpm 振荡条件下孵育，直至 OD₆₀₀ 达到 0.5。
   2. 加入1 μl拷贝数诱导溶液以扩增细胞内fosmid的拷贝数。将细胞在37 °C、250 rpm振荡条件下继续培养3小时。
   3. 为细胞分选做准备，加入0.5 ml培养的细胞及适量的底物（p对硝基苯乙酸酯，p将对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（p-nitrophenyl-β-D-cellobioside）或苯基磷酸盐（phenyl phosphate）加入14 ml圆底试管中，终浓度为100 µM。
      1. 作为对照样品，将3.2步骤中培养的0.5 ml细胞加入至一个14 ml圆底试管中。加入与3.3步骤中底物体积相同的PBS。
   4. 将两个样品在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育3小时。
   5. 同时，使用与步骤 2.3 相同的配置准备 FACS 仪器。
   6. 分别向两个5 ml圆底试管中加入5 µl待分选细胞和对照细胞，每个试管中均含有1 ml PBS。
   7. 将含有对照细胞的试管置于流式细胞仪的上样口，点击流式细胞仪软件采集控制面板上的“加载”按钮。通过控制面板上的流速调节按钮，将事件速率为1,000 - 3,000 事件/秒。
   8. 创建对数-对数缩放的FSC-A 与 通过点击软件全局工作表上的“点图”按钮，生成对数缩放的SSC-A散点图，并使用工具栏上的“多边形门”按钮调整散射门R1，使其包含单细胞事件（细菌群体）。
   9. 创建对数-对数缩放的FSC-A 与 通过单击工作表上的“点图”按钮，生成对数缩放的FITC-A散点图，并使用工具栏上的“多边形门”按钮在图上设置分选门R2，使R2门内检测到的阴性细胞比例低于0.1%。
   10. 将对照样品管更换为分选样品管，通过控制仪表盘上的流速按钮，将事件速率调整至每秒1,000 - 3,000个事件。
   11. 在FACS仪器的出口处放置一个含有0.5 ml LB的收集管，并分选10⁴ 同时满足R1和R2门控条件的细胞
       注意： 分选标准可设定为R2门内FITC-A信号最强的0.1%至5%细胞。在本实验方案中，选取信号最强的1%细胞作为阳性细胞进行收集。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	噬菌粒文库构建试剂盒
CopyControl 诱导溶液	Epicentre	CCIS125	噬菌粒拷贝数诱导溶液
EPI300	Epicentre	EC300110	电转感受态细胞
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	噬菌粒载体
Gene pulser Mxcell	Bio-Rad		电穿孔比色皿及电穿孔系统
FACSAria III	Becton Dickinson		流式细胞仪（FACS 仪器）
AZ100M	Nikon		显微镜
Ultraslim	Maestrogen		LED 照明器
50 ml 锥形管	BD Falcon
14 ml 圆底管	BD Falcon
5 ml 圆底管	BD Falcon
对硝基苯磷酸盐	Sigma-Aldrich	N7653	底物
对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷	Sigma-Aldrich	N5759	底物
对硝基苯基丁酸酯	Sigma-Aldrich	N9876	底物
LB 培养基（Luria-Bertani）	BD Difco	244620	胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L
SOB 培养基（Super optimal broth）	BD Difco	244310	胰蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 0.5 g/L，硫酸镁 2.4 g/L，氯化钾 186 mg/L
含分解代谢抑制的 SOB 培养基（SOC）		SOB, 0.4 % 葡萄糖
2xYT 培养基（2x 酵母提取物胰蛋白胨）	BD Difco	244020	酪蛋白胰酶消化物 16 g/L，酵母提取物 10 g/L，酵母提取物 5 g/L
细胞保存培养基			2x YT 培养基，15% 甘油，2% 葡萄糖
pGESS(E135K)			含有 dmpR 和 egfp 基因及其相应启动子、核糖体结合位点（RBS）和终止子的 DNA 载体。详见文稿中参考文献 5。
氯霉素	Sigma	C0378
氨苄青霉素	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		流式细胞术软件 Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl，0.02% KCl，0.0144% 磷酸氢二钠，0.024% 磷酸二氢钾，pH 7.4