检测转基因细菌细胞中靶酶的表达

摘要

来源：Kim, H. et. al., 利用高通量遗传酶筛选系统进行多酶筛选。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用宏基因组fosmid文库和生色底物检测酶表达的遗传筛选方法。通过流式细胞术识别并分离产生有色产物的单个细胞，从而实现对表达活性酶的细胞进行高通量筛选。

方案

1. 利用基因酶筛选系统制备对硝基苯酚（pNP）的宏基因组文库（pNP-GESS）
   1. 构建宏基因组文库 大肠杆菌 使用fosmid文库构建试剂盒，将目标DNA片段克隆至fosmid载体中。
   2. 分装100 µl文库用于在−70 °C保存，作为宏基因组文库细胞的来源。
      注意： 在600 nm波长处测得的样品光密度（OD₆₀₀该文库储备液的浓度约为100。
   3. 将100 µl宏基因组文库储备液置于冰上解冻，接种至含有50 ml LB（Luria-Bertani）培养基和12.5 µg/ml氯霉素的500 ml三角瓶中，于37 °C振荡培养2小时。
   4. 在4 °C、1,000 x g条件下离心20分钟，用50 ml锥形管收集细胞。
   5. 将沉淀物迅速重悬于50 ml预冷的蒸馏水（DW）中，于4 °C、1,000 × g离心20 min。
   6. 将沉淀重悬于50 µl含10%（v/v）甘油的预冷去离子水中。取50 µl该细胞等分试样用于电穿孔。
   7. 将50 µl电转感受态细胞与100 ng pGESS(E135K) DNA的混合物加入预冷的电穿孔杯中，进行电穿孔（1.8 kV/cm，25 µF）。
   8. 迅速加入1 ml SOC培养基（含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤），并轻轻重悬细胞。
   9. 用移液器....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	噬菌粒文库构建试剂盒
CopyControl 诱导溶液	Epicentre	CCIS125	噬菌粒拷贝数诱导溶液
EPI300	Epicentre	EC300110	电转感受态细胞
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	噬菌粒载体
Gene pulser Mxcell	Bio-Rad		电穿孔比色皿及电穿孔系统
FACSAria III	Becton Dickinson		流式细胞仪（FACS 仪器）
AZ100M	Nikon		显微镜
Ultraslim	Maestrogen		LED 照明器
50 ml 锥形管	BD Falcon
14 ml 圆底管	BD Falcon
5 ml 圆底管	BD Falcon
对硝基苯磷酸盐	Sigma-Aldrich	N7653	底物
对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷	Sigma-Aldrich	N5759	底物
对硝基苯基丁酸酯	Sigma-Aldrich	N9876	底物
LB 培养基（Luria-Bertani）	BD Difco	244620	胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L
SOB 培养基（Super optimal broth）	BD Difco	244310	胰蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 0.5 g/L，硫酸镁 2.4 g/L，氯化钾 186 mg/L
含分解代谢抑制的 SOB 培养基（SOC）		SOB, 0.4 % 葡萄糖
2xYT 培养基（2x 酵母提取物胰蛋白胨）	BD Difco	244020	酪蛋白胰酶消化物 16 g/L，酵母提取物 10 g/L，酵母提取物 5 g/L
细胞保存培养基			2x YT 培养基，15% 甘油，2% 葡萄糖
pGESS(E135K)			含有 dmpR 和 egfp 基因及其相应启动子、核糖体结合位点（RBS）和终止子的 DNA 载体。详见文稿中参考文献 5。
氯霉素	Sigma	C0378
氨苄青霉素	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		流式细胞术软件 Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl，0.02% KCl，0.0144% 磷酸氢二钠，0.024% 磷酸二氢钾，pH 7.4