体外 批式培养模型模拟人肠道菌群的结肠发酵

摘要

来源：Ahmadi, S.，等。一种用于评估干预方案对人类粪便微生物群影响的体外批次培养模型。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种通过在厌氧条件下将粪便样本与膳食可发酵纤维共同孵育，以研究肠道微生物群代谢产物生成的方法，用于模拟肠道微生物发酵过程。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意：请查阅相应的材料安全数据表，并遵守适当的生物安全二级（BSL-2）培训要求。所有培养操作均须遵循标准生物安全规范，并在符合无菌条件的 BSL-2 生物安全柜中进行。此外，来自不同模型及人类受试者的粪便样本可能存在传播微生物源性疾病的风险。如发生任何伤害或感染，应立即寻求医疗救助。此外，使用人类及动物粪便样本须经机构伦理委员会批准，并严格遵守样本及受试者信息使用的相关规程。

1. 培养基的制备

1. 培养基的制备，配制九种母液：
   1. 溶液A（1,000 mL）：溶解5.4 g氯化钠（NaCl）、2.7 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄)，0.16 g 二水合氯化钙（CaCl₂）₂·2H₂O)，0.12 g 六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O)，0.06 g 四水氯化锰（MnCl₂·4H₂O)，0.06 g 六水合氯化钴（CoCl₂·6H₂O) 和 5.4 g 硫酸铵 (NH₄)₂SO₄₄)2SO₄，用去离子水定容至 1,000 mL。
   2. 溶液B（1,000 mL）：溶解2.7 g磷酸氢二钾（K₂HPO₄) 加去离子水至 1000 mL。
   3. 微量元素溶液（1,000 mL）：将500 mg乙二胺四乙酸二钠二水合物（Na₂EDTA·2H₂O）、400 mg七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）、50 mg七水合硫酸锰（MnSO₄·7H₂O）、50 mg一水合硫酸锌（ZnSO₄·H₂O）、25 mg五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、25 mg二水合氯化钴（CoCl₂·2H₂O）、25 mg四水合钼酸钠（Na₂MoO₄·4H₂O）和25 mg六水合氯化镍（NiCl₂·6H₂O）溶于水中，定容至1,000 mL。₂EDTA)，200 mg 七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）₄·7H₂O)，10 mg 硫酸锌七水合物（ZnSO₄·7H₂O)，3 mg 四水合氯化锰(II)（MnCl₂·4H₂O)，30 mg 磷酸（H₃PO₄），20 mg 的 CoCl₂·6H₂O，1 mg 氯化铜二水合物（CuCl₂·2H₂O）₂·2H₂O)，2 mg 六水合氯化镍(II)（NiCl₂·6H₂O) 和 3 mg 钼酸钠二水合物（Na₂MoO₄·2H₂将去离子水定容至 1,000 mL。
      注意： 该溶液对光敏感，因此需保存在避光/黑色或铝箔包裹的试管/瓶子中。
   4. 水溶性维生素溶液（1,000 mL）：将100 mg盐酸硫胺（Thiamin-HCl）、100 mg D-泛酸（D-pantothenic acid）、100 mg烟酸（Niacin）、100 mg吡哆醇（pyridoxine）、5 mg对氨基苯甲酸（P-aminobenzoic acid）和0.25 mg维生素B12溶于去离子水中，定容至1,000 mL。
   5. 叶酸：生物素溶液（1,000 mL）：溶解10 mg叶酸、2 mg D-生物素和100 mg碳酸氢铵（NH₄HCO₃）于水中₄HCO₃) 加去离子水至 1,000 mL。
   6. 核黄素溶液（1,000 mL）：将10 mg核黄素溶解于5 mM HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸）（1.19 g/L）溶液中，定容至1,000 mL。
   7. 血红素溶液（10 mL）：将5,000 mg血红素溶解于10 mM氢氧化钠（NaOH）（0.4 g/L）溶液中，定容至10 mL。
   8. 短链脂肪酸混合物（10 mL）：取2.5 mL正戊酸、2.5 mL异戊酸、2.5 mL异丁酸和2.5 mL DL-α-甲基丁酸，混合均匀。
      注意： 建议在通风橱中使用该溶液，以避免气味和烟雾。
   9. 刃天青（1,000 mL）：将1 g刃天青溶解于去离子水中，定容至1,000 mL。
2. 用于体外厌氧发酵的培养基
   1. 配制该培养基时，混合330 mL溶液A、330 mL溶液B、10 mL微量元素溶液、20 mL水溶性维生素溶液、5 mL叶酸-生物素溶液、5 mL核黄素溶液、2.5 mL血红素溶液、0.4 mL短链脂肪酸混合液、1 mL刃天青、0.5 g酵母提取物、4 g碳酸钠（Na₂CO₃），然后用蒸馏水定容至1 L。₂CO₃），0.5 g 盐酸半胱氨酸（Cysteine HCl-H₂O，以及0.5 g胰蛋白胨，并加入296.1 mL蒸馏水。
   2. 检查pH值，确保其约为7.0；若不符合，用1 N HCl或1 N NaOH调节pH。在无菌操作台中，使用瓶式滤器对培养基进行真空过滤灭菌。
   3. 或者，将所有组分（除维生素和血红素溶液外）混合后，在121 °C下高压灭菌20分钟，并冷却至室温。同时，使用0.22 µm膜滤器对维生素和血红素溶液进行过滤除菌，并在分装前将其加入已灭菌并冷却的培养基中。

2. 厌氧培养箱及所需材料的准备

1. 在发酵实验开始前至少48小时，将实验所需的所有材料、溶液和工具置于厌氧培养箱内，以确保与工具相关的残留氧气以及缓冲液/溶液中的溶解氧被完全去除，并使所有材料适应设定的厌氧条件。
   注意：需提前48小时放入厌氧培养箱的材料包括：(i) 发酵培养基；(ii) 厌氧溶液（按第4.1节方法配制）；(iii) 涡旋振荡器；(iv) 电子天平；(v) 棉质 cheesecloth（纱布）；(vi) 剪刀；(vii) 漏斗；(viii) 1.5、2.0、15、50 mL离心管；(ix) 移液器（2、20、200 和 1,000 µL）及配套的移液器吸头；(x) 刻度移液管及移液管（5 和 10 mL）；(xi) 纸巾；(xii) 记号笔；(xiii) 各种离心管的管架；(xiv) 废物盒；(xv) 氧气指示剂；(xvi) 70%乙醇喷雾瓶（消毒剂）。

3. 管材与纤维的制备

1. 称取300 mg菊粉，转移至50 mL离心管中，随后在厌氧环境中无菌加入26 mL预先配制并储存在厌氧工作站内的发酵培养基。每种粪便样本类型和实验管（根据待测化合物的数量）均需准备一个空白管，并设三个重复。
2. 将这些离心管置于厌氧工作站内约24小时，使样品充分水合后再开始发酵实验。接种时确保离心管温度为37 °C，因此需将离心管放置于厌氧工作站内的培养箱中预热。

4. 接种物的制备

1. 厌氧稀释液（发酵实验前至少48 h配制）：将5 g NaCl、2 g葡萄糖和0.3 g盐酸半胱氨酸溶于去离子水中，定容至1,000 mL。121°C高压灭菌15 min，随后置于厌氧培养箱中至少保存48 h，待用。
2. 粪便接种物制备（发酵实验当天）：称取5 g新鲜粪便样本于50 mL锥形管中，加入厌氧稀释液至终体积50 mL（1:10 w/v），涡旋振荡15 min或直至完全均质化。将均质后的混合液经四层无菌纱布（已高压灭菌）过滤，立即用于含培养基试管的接种。
   注意：若实验目的是比较特定化合物/成分对总体健康人群与疾病人群粪便微生物群的影响，可将一组受试者的粪便样本混合使用。

5. 发酵与取样

1. 按照第4.2节准备试管，并向空白/对照管和实验管中分别接种4 mL稀释并过滤后的粪便接种物。将接种后的试管置于厌氧培养箱内37 °C培养。每小时轻轻倒置振荡一次试管，以重新悬浮纤维和接种物。
2. 根据需要随时采集样品，例如在发酵过程中于0、3、6、9和24小时分别从各发酵管中取出2 mL等分样品至2 mL离心管中。
3. 使用实验室pH计（将pH电极直接插入样品中）测定各样品的pH值；将剩余样品在4 °C下以14,000 × g 离心10分钟。立即用液氮速冻上清液和沉淀，速冻后将上清液于-80 °C保存用于短链脂肪酸（SCFAs）分析，沉淀于-80 °C保存用于微生物组分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	217255
硫酸铵	TGI	C2388	有毒
二水氯化钙	Sigma-Aldrich	C3306	刺激性
六水氯化钴	Sigma-Aldrich	255599
二水氯化铜	Acros organics	2063450000	有毒，刺激性
盐酸半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C121800
D-生物素	Sigma-Aldrich	B4501
D-泛酸	Alfa Aesar	A16609
二水乙二胺四乙酸二钠	Biorad	1610729
DL-α-甲基丁酸	Sigma-Aldrich	W271918
七水硫酸亚铁	Sigma-Aldrich	F8263	有毒
叶酸	Alfa Aesar	J62937
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
血红素	Sigma-Aldrich	H9039
HEPES	Alfa Aesar	A14777
异丁酸	Alfa Aesar	L04038
异戊酸	Alfa Aesar	A18642
六水氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
四水氯化锰	Sigma-Aldrich	221279
烟酸（尼克酸）	Sigma-Aldrich	N4126
六水氯化镍(II)	Alfa Aesar	A14366	有毒
正戊酸	Sigma-Aldrich	240370
对氨基苯甲酸	MP China	102569	有毒，刺激性
磷酸	Sigma-Aldrich	P5811
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5504
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	1551128
吡哆醇	Alfa Aesar	A12041
刃天青	Sigma-Aldrich	R7017
核黄素	Alfa Aesar	A11764
碳酸钠	Sigma-Aldrich	1613757
氯化钠	Fisher BioReagents	7647-14-5
氢氧化钠	Fisher Chemicals	S320
二水钼酸钠	Acros organics	206375000
盐酸硫胺素	Acros organics	148991000
胰蛋白胨	BD Biosciences	211921
维生素B12	Sigma-Aldrich	V2876
酵母提取物	Sigma-Aldrich	70161
七水硫酸锌	Sigma-Aldrich	Z0251
0.22 µm 膜过滤器
AMPure 磁性纯化珠	Agencourt
带培养箱的厌氧室	Forma 厌氧系统，Thermo Scientific，USA
瓶式过滤器	Corning
纱布
pH计
涡旋振荡器	Thermoscientific