克雷伯氏肺炎菌对竹材水解物的微好氧发酵

本视频展示了在微氧和弱酸性条件下，通过在基于水解物的培养基中培养 Klebsiella pneumoniae，将竹源糖类转化为2,3-丁二醇的微生物转化过程。

1. 野生型菌株生产2,3-丁二醇 肺炎克雷伯菌

使用3 L竹子水解物作为培养基制备的溶剂。
制备发酵培养基，其中包含4 g/L玉米浆、2 g/L (NH₄)₂SO₄、6 g/L K₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄和0.2 g/L MgSO₄。使用2.5 M NaOH将培养基pH调节至中性。将3 L已灭菌的发酵培养基加入5-L生物反应器中用于发酵。
使用保存于-80°C低温冰箱中的K. pneumoniae菌种。
对于种子培养，将含有50 mL LB（Luria-Bertani）培养基的250 mL三角瓶在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。LB培养基组成为10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl。注意：种子培养物的菌体密度应达到OD 2（600 nm处的光密度值）。
将50 mL种子培养液接种至生物反应器中。维持培养体系pH为6.0，温度为37 °C。通气速率为2 L/min，搅拌速率为250 rpm，以形成微氧环境。
在发酵过程中每2小时采集5 mL样品，并采用高效液相色谱法分析发酵液中各化学物质的浓度。
使用微生物燃料电池系统/数据采集系统（MFCS/DA）在线监测生物反应器中所添加的碱量。
注意：发酵过程中会产生有机酸，需添加NaOH以维持培养体系pH稳定。所添加碱的体积反映了产酸量。当加碱曲线趋于平缓时，表明发酵过程结束，原因可能是碳源耗尽或细胞死亡。

2. R乙偶姻的生产由 budC 突变体 K. pneumoniae

制备用于乙偶姻生产的培养基，其中包含 4 g/L 玉米浆粉、2 g/L (NH₄)₂SO₄、3 g/L 醋酸钠、0.4 g/L KCl 和 0.1 g/L MgSO₄。
使用 K. pneumoniae-ΔbudC 进行 R-乙偶姻生产。重复步骤 1.4–1.5。
注意： budC 编码 2,3-丁二醇脱氢酶。K. pneumoniae-ΔbudC 缺失 2,3-丁二醇脱氢酶活性，因而生成 R-乙偶姻而非 2,3-丁二醇。
将培养体系维持在 pH 6.0 和 37 °C 条件下。通气速率为 4 L/min，搅拌速率为 450 rpm，保持好氧条件。
注意： 此过程的氧气供给量高于 2,3-丁二醇生产所需。
按照步骤 1.6 对样品进行检测。

3. 2-酮基葡萄糖酸的生产方法 budA 突变体 K. pneumoniae

进行2-酮基葡萄糖酸生产时，使用与R-乙偶姻生产相同的培养基。
使用K. pneumoniae-ΔbudA进行2-酮基葡萄糖酸生产。重复步骤1.4–1.5。
注意：budA编码α-乙酰乳酸脱羧酶。K. pneumoniae-ΔbudA缺失α-乙酰乳酸脱羧酶活性，能够以葡萄糖为底物生产2-酮基葡萄糖酸。
注意：2-酮基葡萄糖酸的合成是一个依赖酸性条件的过程。已开发出两阶段发酵法用于2-酮基葡萄糖酸的生产；在第一阶段，将种子培养物接种至生物反应器中。
将培养物维持在pH 7.0和37 °C条件下。通气速率为4 L/min，搅拌速率为500 rpm。
注意：在此条件下，细胞生长非常迅速（约4小时内菌体密度达到OD 7）。随后发酵进入第二阶段，此时培养液pH自然下降至5.0。无需额外添加酸，培养过程中产生的有机酸会自然导致pH降低。在此酸性条件下，细胞生长停止，但2-酮基葡萄糖酸持续合成并在发酵液中积累。
按照步骤1.6的方法对样品进行检测，使用竹子水解物作为碳源。
注意：培养基中的葡萄糖被转化为2-酮基葡萄糖酸，木糖则被转化为木糖酸。因此，最终获得的是2-酮基葡萄糖酸与木糖酸的混合物。

本文内容