基于液相色谱-质谱联用技术的代谢物分析方法 S. aureus

摘要

来源： Samuels, D. J., 等 一种基于串联液相色谱-质谱法的代谢物分析方法 金黄色葡萄球菌. 视频实验杂志 (2017)

本视频演示了使用液相色谱-质谱联用技术鉴定和定量金黄色葡萄球菌（S. aureus）细胞内代谢物的方法。内容涵盖了代谢物提取、多肽归一化、液相色谱以及质谱分析等步骤。

方案

1. 代谢物提取

1. 将样品置于湿冰上解冻，使用匀浆器以6,000 rpm进行四次、每次30秒的破碎处理，每次循环之间置于干冰上冷却2分钟。
2. 在预冷的低温微量离心机中以最大速度离心15分钟，澄清裂解液即， 18,213 × g，≤4 °C
3. 将上清液转移至干净的微量离心管中。
4. 使用微量移液器将样品的一小部分转移至微量离心管中，用于步骤2中残留肽含量的定量；其余样品储存于-80 °C。
   注意： 保留样品的体积因第2.1步中使用的二喹啉酸（BCA）测定方法而异。该样品应置于湿冰上用于立即分析，或在-80 °C下冷冻保存。

2. 双辛可宁酸（BCA）测定

1. 按照试剂盒制造商的建议，使用步骤1.4中的样品进行BCA检测，以测定每个样品的残留肽浓度。

3. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）

1. 混合 75 µL 的 Staphylococcus aureus (金黄色葡萄球菌 用步骤 1.4 中配制的 75 µL LC-MS 溶剂 B 进行萃取
2. 涡旋混匀，然后在13,000 × g下离心5分钟。
3. 将100 µL上清液加入液相色谱（LC）小瓶中并盖上瓶盖。确保样品中无气泡残留。
4. 将液相色谱小瓶装载到液相质谱自动进样器上，并在软件“Offline Worklist Editor”中编辑运行序列。
   1. 填写“样本名称”（例如， 野生型-1），“样品位置”（例如， P1-A1），“方法”（例如， 甲酸阴性法）和“数据文件”（例如， 野生型-1）列。点击“保存工作列表”按钮。打开“质谱数据采集工作站”软件，并导入先前保存的工作列表。点击“启动工作列表运行”按钮，开始连续的液相色谱-质谱检测。
5. 在色谱柱上分离样品，将色谱柱连接至飞行时间（TOF）质谱仪，并将TOF质谱仪与液相色谱系统耦合。采用以下流动相梯度：0–2 min，85% 溶剂B；3–5 min，80% 溶剂B；6–7 min，75% 溶剂B；8–9 min，70% 溶剂B；10–11.1 min，50% 溶剂B；11.1–14 min，20% 溶剂B；14.1–24 min，5% 溶剂B；最后在85% 溶剂B条件下以0.4 mL min的流速平衡10 min^-1.
6. 使用等度泵将参考质量溶液注入运行过程中，以实现质量轴的同步校准。
   注意： 此步骤基于标准的飞行时间质谱仪操作手册。
   1. 使用乙酸-D4与六(1H,1H,3H-四氟丙氧基)磷嗪的混合物作为参考质量校准溶液进行实时校准。使用等度泵，流速为2.5 mL min⁻¹。^-1 用于输注。

4. 离子计数的批次校正

1. 指定任一样本作为批次校正的参考样本（例如，野生型，重复1）。
2. 计算参考样本中所有代谢物的离子计数总和。对所有样本重复此计算。
3. 将每个样本的总离子计数除以参考样本的总离子计数，得到一个比值。
4. 将样本中每个代谢物的离子计数除以该样本与参考样本的比值，从而获得每个代谢物的批次校正后离子计数。

5. 肽段归一化

1. 将第4步中获得的各样本批次校正后的离子计数值除以第2步中通过BCA法测定的肽浓度，从而得到每个代谢物的标准化值。
   注意： 第5.1步获得的每个代谢物的标准化且批次校正后的离子计数值可在不同菌株间直接比较，并进行统计分析（例如，Mann-Whitney U检验）。或者，可选用一种已知在处理或遗传背景变化下保持不变的代谢物作为标准化参照，以检测因代谢物降解引起的变化。在提取缓冲液中加入已知量的L-正缬氨酸或戊二酸，可用于校正样品处理过程中的损失。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料/设备
耐冲击管，2 mL	USA Scientific	1420-9600
二氧化硅珠，0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 均质仪	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond 氢化物 C 型色谱柱	Agilent	70000-15P-2
准确质量飞行时间（TOF）液相色谱-质谱仪，6200 系列	Agilent	G6230B
四元泵，1290 系列	Agilent	G4204A
二元泵，1290 系列	Agilent	G4220A
阀驱动器，1290 系列	Agilent	G1107A
等度泵，1290 系列	Agilent	G1310B
柱温箱，1290 系列	Agilent	G1316C
自动进样器，1290 系列	Agilent	G4226A
恒温器，1290 系列	Agilent	G1330B
化学试剂
磷酸盐缓冲液（pH 7.4），10x	Ambion	AM9624	使用超纯水新鲜稀释至 1x
乙腈	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
甲酸	Sigma Aldrich	94318	用于质谱分析，98%
MassHunter	Agilent	G3337AA
细菌菌株	物种	菌株	基因型
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	野生型
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm