使用自动化微生物反应器监测不同培养基配方中的细菌生长

摘要

来源： Hemmerich, J., et al. 利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的实验方案. J. Vis. Exp. (2017).

本视频展示了利用自动化微型生物反应器监测细菌在不同培养基配方下的生长情况及荧光蛋白分泌的方法。将表达分泌型荧光蛋白的基因工程菌在抗生素筛选条件下培养后，接种至营养成分不同的微孔中。通过实时光学检测细胞密度和荧光强度，可对不同生长条件下蛋白的表达水平进行比较分析。

方案

1. 材料准备与定义步骤
注意： 建议在详细层面上定义并固定实验方法。这种标准化可确保不同结果能够追溯至内在的生物学变异或培养基成分的差异。​
注意： 培养基储备液：为所有被研究的培养基组分分别配制单独的储备液。储备液应配制成高浓度，以便根据不同组分的需求稀释成不同体积。这意味着，按照实验设计将所有储备液以其最大体积混合后，总体积不得超过最终培养体积。 参见 配制培养基母液加样列表的第1.3.3步。如果加入高浓度溶液会导致加样体积过小， 例如， < 最终培养体积的1/100，相应稀释储备液。例如，在本研究中，定义少于10 µL的移液体积为不可行。通常，微量元素溶液相对于培养基中的最终标准浓度可浓缩至1,000倍。将培养基组分相对于参考配方中的浓度以若干倍（X倍）进行浓缩是有利的，这样可避免出现难以操作的微量小数移液体积。CgXII培养基所有储备液的详细配方见补充文件。

1. 工作细胞库（WCB）
注意：每个生长实验使用一份WCB分装样品。若需要更多分装样品，可使用100 mL脑心浸液（BHI）培养基加入1,000 mL带挡板的摇瓶中，或接种多个摇瓶，然后在加入甘油溶液前将各瓶培养物混合。

1. 在琼脂平板（37 g/L BHI 粉末，20 g/L 琼脂，25 mg/L 卡那霉素）上培养重组表达菌株 C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 的单菌落。接种材料可来自新鲜转化产物或冻存的菌液 aliquot。于 30 °C 培养至出现单菌落，通常需要一到两天。
2. 用单菌落接种摇瓶培养物（50 mL BHI 培养基含 25 mg/L 卡那霉素，500 mL 带挡板摇瓶，250 rpm，25 mm 摇动直径，30 °C），过夜培养（约 16 小时）。
3. 将所得菌悬液与等体积的 500 g/L 无菌甘油溶液混合，分装至无菌冻存管中，每管 2 mL。于 -80 °C 保存。

2. MBR 培养方案
注意： 本研究中所采用的BioLector MBR系统，散射光（生物量）和GFP荧光均为强度测量，需设定相应的增益值。增益越高，光学信号的放大程度越高；因此散射光和荧光均以任意单位（a.u.）表示。应在预实验中确定生物量和GFP检测的合适增益值，同时确定合适的振荡频率和装液量，以避免在后续工艺阶段高生物量浓度下出现氧限制。所采用的培养条件（“Flowerplates”） 即，花形48孔微孔板，振荡频率1,200 rpm，装液量1,000 µL，以10 g/L葡萄糖为主要碳源）可确保培养过程不受氧限制。关于花形48孔微孔板在不同装液量与振荡频率组合下所产生的最大氧传递速率，供应商可提供相应的数据表。此外，个别培养物可能出现生长缺陷，原因可能是次要底物含量较低（例如，氮，微量元素）。因此，需在培养结束时检测生物量浓度。本研究中未观察到此类生长效应。

1. 定义膜生物反应器系统（“BioLector”）的培养方案如下：
2. 滤光片组1：生物量，增益14。滤光片组2：pH，增益已预设。滤光片组3：pO2，增益已预设。4：GFP，增益80。
3. 振荡频率：1,200 rpm。
4. 温度：30 °C。
5. 循环时间：15 分钟。
6. 实验时间：手动控制（培养不会自动停止）。

3. 中等浓度储备溶液配制的移液操作列表生成
注意： 几乎所有液体处理机器人系统都能够从外部文件读取移液操作。基本所需信息包括转移体积、试剂来源的位置，以及目标位置，后者由机器人工作台上的耗材位置及耗材内的特定孔位共同表示。然而，必须考虑不同液体处理系统所采用的不同语法格式。图1展示了本研究中所用移液系统的一个示例文件结构。

1. 四种类型的储备溶液被移液至每个培养孔中：

1. 需要变化的培养基组分的储备液（“变化储备液”）。
2. 用于补偿上述储备液总体积差异的水。
3. 包含所有固定组分的储备液（“固定组分储备液”）。该储备液可由含有不同组分的子储备液配制而成，这些子储备液可能 e.g. 需在不同温度下保存或采用不同的灭菌方法。
4. 接种物，应作为最后一种组分加入，并在即将加入前才放置到工作台上，以避免细胞沉降。

2. 每个培养孔，根据以下公式计算所有培养基组分的转移体积：

需添加的体积 变异品系 可能为零， 即，当省略此特定组分时。

3. 根据实际情况调整所有计算体积 Vi，使其为合适的数值。移液体积的增量步长不应过小。如有必要，调整Variation Stocks的浓度。例如，此处定义的最小移液体积为 10 µL，最小增量为 5 µL。通常，这些体积应根据所用液体处理工作站实验测定的精密度和准确度来确定。

4. 按如下方法计算包含所有孔中固定组分的Rest Stock体积：

其中使用了Variation Stock 的最大累积体积。随后，按如下公式计算Rest Stock中各固定组分所需的浓度：

据此配制Rest Stock。

5. 每个培养孔中需添加的水的体积按如下公式计算：

每个培养孔中需按以下添加顺序列出所有需加入的体积：V_H2O、V_RestStock、V_i、V_Inok。请根据液体处理工作站的要求格式化移液列表，示例见图1。

2. 种子培养、自动化培养基制备及主培养的启动

1. 为液体处理机器人创建一个操作程序。有关在相应“WinPREP”软件中实现的“Janus”系统的操作程序示例，请参见图2和图3。该程序应考虑以下方面：

1. 在培养基制备前，应包含足够时间的无菌饲养环境运行。

2. 对所有移液枪头和管路进行初步的彻底清洁和冲洗。

3. 为储备液选择合适的实验器皿容器。此处，具有12列的深孔板适用于储存Variation Stocks，因为八通道移液器的全部八个吸头可平行地同时浸入各孔列中，从而显著加快培养基的配制速度。若使用15 mL或50 mL试剂管作为储液容器，则每次仅能浸入一个移液吸头。对于水和Rest Stock等其他储备液，使用100 mL槽式板，因为这些储备液总体积需求较大。

4. 为每种储备液提供足够的总体积，以补偿损耗体积和移液高度偏差， 等等。

5. 在接种步骤之前插入一个用户提示，确保该步骤在种子培养操作前立即执行。

2. 以无菌方式配制所有储备液，并将其储存于适当的容器中，直至使用。 例如无菌的15 mL和50 mL试管。
3. 在工作台上对用于储存储备溶液的深孔板进行灭菌， 例如用70%乙醇擦拭，并在超净工作台中干燥。
4. 通过将一份WCB接种到含有25 mg/L卡那霉素的50 mL BHI培养基中，启动种子培养。在MBR培养前，从处于对数生长期的种子培养物中制备足量的新鲜且具有活性的接种物。
5. 将所有必要的实验器具放置于机器人工作台，并将储备溶液倒入相应的实验器具中。
6. 启动用于培养基制备的机器人工作流程，确保在种子培养开始时同步完成最后一步（接种）。机器人工作流程的总运行时间需预先评估。此处总运行时间约为1.5 h。
7. 在约2小时后取种子培养物样品，之后每小时取样一次，通过光密度（OD）监测生长情况₆₀₀）。培养约5小时后，菌液浓度达到3-4 OD₆₀₀ 用于接种主培养物。
8. 将种子培养物置于液体处理工作站台面上，并继续进行培养基制备程序。接种后密封培养用MTP。
9. 将密封的培养MTP放入BioLector设备中，并启动预设的培养程序。
10. 根据生物安全规定，必要时处理剩余的储备溶液，并从机器人工作台接种培养物。清洗可重复使用的实验器具，并启动液体处理设备的去污程序。

结果

图1：用于敏感性分析的体积移液列表截图。 第一列中的条目为每一行的所有体积分配一个唯一标识符；该标识符是液体处理工作站工作台面上目标培养MTP的MTP孔编号。 参见 图 3C其余列分别编码需移取的不同溶液的体积（“Sln-01”至“Sln-15”）。每一行的累计体积对应于相应孔的最终培养体积。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	用于 BioLector 仪器中的培养
密封膜	m2p-labs	F-GP-10	Flowerplate 的无菌密封
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	可免费获取，需安装 MATLAB
Janus 移液机器人	Perkin Elmer	n/a	包含“WinPrep”软件安装
12 列深孔微孔板	E&K Scientific	EK-2034	用于储存培养基储备液
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	n/a	n/a	携带 pEKEx2 质粒，其中包含 GFP 基因与来自 B. subtilis 的 PhoD 信号肽的融合表达插入片段。该质粒提供卡那霉素抗性。由 Meissner 等人描述并发表于 Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)