使用甘油或二甲基亚砜对蓝藻菌株进行长期低温保存

摘要

来源：Lea-Smith, D. J., et al．模式蓝细菌物种中标记型与无标记突变体的构建．J. Vis. Exp. (2016)

本视频通过将浓缩的蓝细菌悬液与甘油或DMSO混合并在低温下保存，展示了蓝细菌菌株的冷冻保存方法，从而实现光合作用和遗传学研究中活性培养物的长期保藏。

方案

1. 培养基的制备

1. 制备 BG11 培养基
   1. 配制 100 倍浓缩的 BG11、微量元素和铁储备液（表 1）。
   2. 分别配制磷酸盐储备液、碳酸钠（Na₂CO₃）储备液、N-[三（羟甲基）甲基] -2-氨基乙磺酸（TES）缓冲液和碳酸氢钠（NaHCO₃）（表 1）。
   3. 对磷酸盐和 Na₂CO₃ 储备液进行高压灭菌。使用 0.2 µm 滤膜过滤灭菌 TES 缓冲液和 NaHCO₃。
   4. 通过混合 976 ml 水、10 ml 100x BG11、1 ml 微量元素和 1 ml 铁储备液来制备 BG11，并对溶液进行高压灭菌。待溶液冷却至室温后，加入 1 ml 磷酸盐储备液、1 ml Na₂CO₃ 储备液和 10 ml NaHCO₃。
   5. 对于固体 BG11 培养基，向一个烧瓶中加入 15 g 琼脂和 700 ml 水。向第二个烧瓶中加入 3 g 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）、226 ml 水、10 ml 100x BG11、1 ml 微量元素和 1 ml 铁储备液。将两种溶液分别高压灭菌。待溶液冷却至室温后，将其混合，并加入 1 ml 磷酸盐储备液、1 ml Na₂CO₃ 储备液、10 ml TES 缓冲液和 10 ml NaHCO₃。
      注意：溶液需分别配制，以避免某些盐类沉淀。
2. 用于蔗糖筛选时，配制 50%（w/v）蔗糖溶液。使用 0.2 µm 滤膜过滤灭菌该溶液，并将其加入 BG11 中（将 100 ml 50% 蔗糖加入 900 ml BG11），以制备含 5% 蔗糖的 BG11 平板。
   注意：不要向含 5% 蔗糖的 BG11 琼脂平板中添加 NaHCO₃。应正常添加 Na₂CO₃。
3. 培养 Synechococcus 时，向 1 L BG11 培养基中加入 10 ml 1 M 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)（HEPES）和 1 ml 维生素 B12（表 1）。
   注意：在市售 BG11 培养基中培养的菌株转化效率显著低于本文所述 BG11 配方，因此不推荐使用。

2. 菌株的长期保存

1. 通过将一环菌体接种到30-50 ml BG11培养基中，建立该菌株的新鲜培养物。培养3-4天，使光密度OD_750nm达到0.4至0.7。
2. 用BG11培养基洗涤菌体一次，并重悬于约2 ml BG11中。
3. 取0.8 ml浓缩菌液加入一个离心管中，然后加入0.2 ml 80%过滤除菌的甘油。
4. 可选：将0.93 ml浓缩菌液加入另一管中，再向该管中加入0.07 ml DMSO。
   注意：DMSO具有毒性，操作时应采取适当的防护措施。
5. 将两个离心管均于-80 °C保存。复苏菌株时，取出离心管，用无菌牙签刮取少量菌液涂布于不含抗生素的琼脂平板上，然后用无菌接种环按常规方法划线分离。

表1：本研究中使用的溶液

储备液配方
化学物质	用量（g）
100倍 BG11（每升）
NaNO3	149.6
MgSO4.7H2O	7.49
CaCl2.2H2O	3.6
柠檬酸	0.6
加入 1.12 ml 0.25 M Na2EDTA，pH 8.0
0.25 M Na2EDTA，pH 8.0（每 100 ml）
Na2EDTA	9.3
微量元素（每 100 ml）
H3BO3	0.286
MnCl2.4H2O	0.181
ZnSO4.7H2O	0.022
Na2MoO4.2H2O	0.039
CuSO4.5H2O	0.008
Co(NO3)2.6H2O	0.005
铁储备液（每 100 ml）
柠檬酸铁铵	1.11
磷酸盐储备液（每 100 ml）
K2HPO4	3.05
Na2CO3 储备液（每 100 ml）
Na2CO3	2
TES 缓冲液，pH 8.2（每 100 ml）
TES	22.9
NaHCO3 储备液（每 100 ml）
NaHCO3	8.4
HEPES，pH 8.2（每 500 ml）
HEPES	119.15
维生素 B12（每 50 ml）
氰钴胺	0.02
LB 培养基（每 500 ml）
LB 肉汤	12.5
1 M MgCl2（每 100 ml）
MgCl2.6H2O	20.33
溶液 A（每 200 ml）
MnCl2.4H2O	0.395
CaCl2.2H2O	1.47
2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物，4-吗啉乙磺酸（MES）	0.4265
溶液 A + 甘油
10 ml 溶液 A
1.5 ml 甘油

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
柠檬酸	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Fisher	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
柠檬酸铁铵	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
氰钴胺	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto 琼脂	BD	214010
蔗糖	Fisher	SUC001
90 mm 三通气式培养皿	Greiner	633185
0.2 µm 滤膜	Sartorius	16534
100 ml 锥形瓶	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm × 38 m	Bemis	FIL003
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	Phusion	F-530
琼脂糖	Melford	MB1200
DNA 纯化试剂盒	MoBio	12100-300
限制性内切酶	NEB
T4 连接酶	Thermo Scientific	EL0011
LB 肉汤	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
硫酸卡那霉素	Sigma	60615
氨苄青霉素	Sigma	A9518
GeneJET 质粒小提试剂盒	Thermo Scientific	K0503
14 ml 圆底管	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶	Promega	M7805
425–600 µm 玻璃珠	Sigma	G8772
甘油	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
荧光灯管	Gro-Lux	69
HT multitron 光生物反应器	Infors