体外利用Opson化红细胞建模补体介导的吞噬作用

摘要

来源： Nagre， N. 等。 小鼠的肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除。J . Vis. Exp. （2019）。

本视频展示了利用经IgM和补体调适的绵羊红细胞，随后被小鼠巨噬细胞摄取补体受体介导的吞噬作用。吞噬作用的程度通过测量由血红蛋白催化的二氨氟氧化形成的蓝色染色产物来量化。

方案

1. FcγR和CR介导的吞噬作用

1. 作顺子化时，将2 x 10⁸ 只绵羊红细胞（SRBCs）与50微升兔抗SRBC-IgM或50微升兔子抗SRBC-IgG在室温下孵育30分钟。
2. 将IgM作过的SRBC与50微升C5缺失（C5D）人血清在37°C下孵育30分钟，固定IgM包覆SRBC上的补体片段C3b和C3bi。
3. 将小鼠巨噬细胞（MH-S细胞）（每孔10,000细胞）置于96孔板中，隔夜孵育以达到~70%的汇聚度。在每个MH-S细胞孔中加入100微升1 x 10 7/mL的作性SRBCs，并在37°C下培养1小时。用100微升氯化铵钾（ACK）溶解缓冲液快速（~1分钟）清洗未结合的SRBCs。
4. 用0.1%的SDS裂解细胞，加入50微升含3%过氧化氢和6M尿素的2,7-二氨氟烯（DAF）。测量620纳米处由血红蛋白催化的氟蓝形成的吸收率。
5. 通过使用620纳米吸收值的标准曲线，且已知数量的SRBCs，确定SRBC的数量。同样，将工艺MH-S细胞与非作性SRBC一起孵育，作为负性对照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,7-二氨氟烯（DAF）	西格玛-奥尔德里奇	D17106	分子生物学等级
70% 乙醇	Decon 实验室公司	18C27B	分析等级
96孔板	科宁	3603	细胞生物学等级
ACK裂解缓冲液	生命科技	A10492	分子生物学等级
C5缺乏血清	西格玛-奥尔德里奇	C1163	生化试剂
离心机	Labnet 国际	C0160-R
细胞旋转蛋白4型细胞离心机	Thermofisher 科学	A78300101 第11期
DMEM细胞培养基	吉布科	11995-065	细胞生物学等级
FBS	亚特兰大生物制品	S11550	细胞生物学等级
流式细胞仪	BD生物科学	FACSCalibur
Flow Jo 软件	FlowJo有限责任公司
镊子	杜蒙	0508-SS/45-PS-1	适合实验动物解剖
玻璃底盘	MatTek公司	P35G-0.170-14-C	细胞生物学等级
高压注射器	宾夕法尼亚世纪	FMJ-250	适合实验动物使用
均质器	全能国际	TH-01
过氧化氢	西格玛-奥尔德里奇	H1009	分析等级
倒置荧光显微镜	奥林匹斯	IX73
微喷雾器	宾夕法尼亚世纪	IA-1C	适合实验动物使用
对甲醛	西格玛-奥尔德里奇	P6148	试剂级
PBS	吉布科	20012-027	细胞生物学等级
兔子抗SRBC-IgG	MP生物医学	55806	适合免疫测定
兔子反SRBC-IgM	雪松实验室	CL9000-M	适合免疫测定
剪刀	米尔泰克斯	5-2	适合实验动物解剖
羊红细胞（SRBCs）	MP生物医学	55876	洗净保存的SRBCs。