利用体外致敏红细胞模拟补体介导的吞噬作用

摘要

来源：Nagre, N., 等．小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除实验．J. Vis. Exp. (2019)．

本视频演示了利用经IgM和补体调理的绵羊红细胞评估补体受体介导的吞噬作用，随后由小鼠巨噬细胞摄取这些红细胞。通过检测血红蛋白催化二氨基荧光素氧化生成的蓝色显色产物，对吞噬作用的程度进行定量分析。

方案

1. FcγR 和 CR 介导的吞噬作用

1. 进行调理作用时，将 2 × 10⁸ 个绵羊红细胞（SRBCs）与 50 µL 兔抗SRBC-IgM 或 50 µL 兔抗SRBC-IgG 在室温下孵育 30 分钟。
2. 将经IgM调理的SRBCs与 50 µL C5缺陷型（C5D）人血清在 37 °C 下孵育 30 分钟，以使补体片段 C3b 和 C3bi 固定在IgM包被的SRBCs上。
3. 将小鼠巨噬细胞（MH-S细胞）以每孔 10,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，过夜培养至约 70% 汇合度。向每孔 MH-S 细胞中加入 100 µL 浓度为 1 × 10⁷/mL 的调理SRBCs，于 37 °C 孵育 1 小时。用 100 µL 氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液快速洗涤未结合的SRBCs（约 1 分钟）。
4. 用 0.1% SDS 裂解细胞，加入含 3% 过氧化氢和 6 M 尿素的 50 µL 2,7-二氨基芴（DAF）。在 620 nm 处测定血红蛋白催化生成芴蓝的吸光度。
5. 利用已知数量SRBCs绘制的标准曲线，根据 620 nm 处的吸光度值确定SRBCs的数量。同样地，将与未调理SRBCs孵育的MH-S细胞作为阴性对照进行处理。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,7-二氨基芴（DAF）	Sigma-Aldrich	D17106	分子生物学级
70% 乙醇	Decon Labs Inc.	18C27B	分析纯
96孔板	Corning	3603	细胞生物学级
ACK裂解缓冲液	Life Technologies	A10492	分子生物学级
C5缺陷血清	Sigma-Aldrich	C1163	生化试剂
离心机	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 细胞离心涂片机	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM细胞培养基	Gibco	11995-065	细胞生物学级
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	细胞生物学级
流式细胞仪	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo 软件	FlowJo, LLC
镊子	Dumont	0508-SS/45-PS-1	适用于实验动物解剖
玻璃底培养皿	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	细胞生物学级
高压注射器	Penn-Century	FMJ-250	适用于实验动物使用
匀浆器	Omni International	TH-01
过氧化氢	Sigma-Aldrich	H1009	分析纯
倒置荧光显微镜	Olympus	IX73
MicroSprayer 气溶胶喷雾器	Penn-Century	IA-1C	适用于实验动物使用
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	试剂级
PBS	Gibco	20012-027	细胞生物学级
兔抗SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	适用于免疫检测
兔抗SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	适用于免疫检测
剪刀	Miltex	5-2	适用于实验动物解剖
绵羊红细胞（SRBCs）	MP Biomedicals	55876	洗涤并保存的SRBCs