成像人类肺组织中细菌定位及宿主相互作用

摘要

来源：Mills, B., 等，利用共聚焦激光内窥显微镜对新型细菌特异性探针在离体人肺组织上的光学筛选。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用光纤共聚焦荧光显微镜对悬浮液及肺组织中的荧光标记金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进行实时成像。

方案

1. 共聚焦激光内窥显微镜（CLE）的数据采集
   1. 设置完成后，将弹出一个用于选择存储位置和文件前缀的窗口。请选择用于存储数据的目标文件夹，并相应地命名文件前缀。
   2. 将脚踏板放置在操作者易于触及的位置。左踏板：激光开启/关闭；中踏板：暂停；右踏板：录制/停止。
      注意： 激光控制也可通过屏幕上的控件进行操作。
   3. 在屏幕上单击“start”或踩下左脚踏板以开启激光器。这将启动图像采集，使用100%激光功率和每秒12帧的帧率进行成像（默认设置）。
      注意： 对于其他应用，可根据样本类型在屏幕上必要时调整这些设置。
   4. 对每份细菌悬液样品进行成像。
      1. 将光纤共聚焦荧光显微成像光纤的远端插入样本悬液中，并缓慢移动光纤以检测样本。
      2. 通过踩下右脚踏板或点击屏幕上的录制控件，在光纤缓慢移动环绕样品的过程中录制任意时长（最长10分钟）的视频。
      3. 用8% H清洁FCFM成像光纤的远端₂O₂ 以及在样品之间使用镜头清洁纸巾清洁镜头。​
         注意： 典型的视频长度为10-30秒即已足够 体外 成像
   5. 对每份肺组织样本进行成像。
      1. 将FCFM成像光纤的远端插入样品中，确保光纤末端与组织直接接触。轻轻移动成像光纤末端以扫描检测样品。
         注意： 将光纤末端从组织上抬起会使组织移出焦平面；然而，此方法可用于成像未黏附于组织的标记细菌。
      2. 通过踩下右脚踏板或选择屏幕上的录制控件，在光纤缓慢移动环绕样品时录制任意时长（最长10分钟）的视频。
         注意： 通常，30秒的视频长度已足够 离体 组织成像
      3. 用镜头清洁纸和8% H清洁FCFM成像光纤的远端₂O₂ 样本之间

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-14 微型离心机	SciQuip	90616	小型台式微量离心机
96 孔板	Corning	3370	检测用板
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	商用荧光染料
Cellvizio 488 nm 研究用 CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	共聚焦激光内窥显微成像设备
Cletop-S	Cletop	14110601	光纤清洁器
Eppendorf (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	1.5 mL 微量离心管
Gibco 磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - 洗涤用培养基
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	用于研究型 CellVizio 488 nm 系统的数据采集与处理软件
非标准研究用 AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	光纤共聚焦荧光显微成像光纤
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	CellVizio 488 系统校准试剂盒
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	本研究所用的细菌菌株
半微量分光光度计比色皿	Sigma Aldrich	C5416-100EA	用于分光光度测定
Thermomixer comfort	Eppendorf	41102422	带振荡功能的台式恒温混匀仪