选择性清洗 秀丽隐杆线虫 用于富集肠道微生物群的线虫

摘要

来源：Morgan, E., 等. 野生Caenorhabditis线虫的选择性清洗以富集肠道微生物组细菌。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了一种从野生秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis）中分离目标肠道细菌的实验方案。首先对线虫进行饥饿处理并清洗，以去除其体表及肠腔内残留的食物细菌，同时保留目标微生物。经过表面清洁和多次爬行步骤后，解剖线虫以获取含有目标细菌的肠道组织，随后收集并冷冻保存。

方案

1. 肠道解剖及微生物物种的PCR鉴定

1. 在 20 °C 下培养动物 3-4 天，使其饥饿并减少 OP50-1（Escherichia coli 菌株 OP50-1）细菌的数量。向饥饿的线虫培养板中加入 5 mL M9 培养基。

2. 使用无菌玻璃移液管和吸球，将M9培养基中的线虫从培养皿中吸出，并转移至无菌的15 mL离心管中。

3. 使用临床离心机，在室温下以 1000 × g 离心试管中的线虫 30 秒。

4. 使用无菌的15 mL移液管，从离心管中移除上清液，注意不要扰动管底的活线虫。

5. 加入 10 mL M9 + 0.05% Triton X-100，将离心管置于旋转混合仪上孵育 20 分钟，以去除体表微生物。重复此步骤四次以清洗线虫。

6. 最后一次洗涤后，使用无菌移液器吸头，移除上清液，注意不要扰动管底的沉淀物，保留100 µL溶液。

7. 使用无菌的移液器吸头，将M9培养基和线虫转移至未接种的NGM平板上，让平板干燥，同时让线虫在平板上爬行20分钟，以帮助去除体表和肠道内的OP50-1。

8. 向干燥的平板中加入 250 µL M9，使用玻璃移液管将含有线虫的 M9 转移至新的未接种 NGM 平板。再次让平板干燥，并让线虫爬行 20 分钟。

9. 向培养皿中加入 250 µL M9 液体，然后取 100 µL M9 + 线虫转移至洁净的表玻璃中。

10. 使用两根无菌的26 G注射针头，用一根针固定线虫，另一根针切断其头部以进行去头操作。去头后，肠道（呈颗粒状）和性腺（透明）会自然从体腔中排出。

11. 用一根针固定暴露的肠管，用另一根针剪下一段肠组织。

注意：如果可能，使用微分干涉差显微镜（Normarski显微镜）、荧光原位杂交（FISH）或免疫组织化学方法，验证目标微生物是否仍存在于外翻的肠道中。

12. 将单个解剖得到的肠道转移至含有 10 µL 无菌水的 0.5 mL PCR 管中。对至少 5 个 PCR（聚合酶链式反应）管重复此操作，每个管中分别含有来自不同动物的肠道组织。

13. 将 PCR 管在 -80 °C 下冷冻至少 5 分钟。从冷冻机中取出 PCR 管，解冻样品。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	菲舍尔科技	BP1356
10% SDS	英坦科技	AM9822
BD PrecisionGlide 针头 - 26 G	菲舍尔科技	305115
KH₂PO₄	菲舍尔科技	P-286
NaCl	菲舍尔科技	S-671
NH₄Cl	菲舍尔科技	A-661
链霉素	密理博-西格玛	S6501-50G
四环素	密理博-西格玛	T7660-5G
吐温 X-100	菲舍尔科技	BP-151
表面皿	VWR	470144-850