小鼠肠道切片中肠道细菌的荧光原位杂交

摘要

来源： Ng, K. M., Tropini, C. 通过荧光成像可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像 视频实验杂志 (2021).

本视频演示了荧光原位杂交（FISH）的操作流程，通过将荧光探针与细菌rRNA（核糖体核糖核酸）杂交，对小鼠肠道组织中的肠道微生物群进行染色，并对宿主结构进行复染，以用于显微分析。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准

1. 使用FISH（荧光原位杂交）对细菌进行染色
   1. 使用液体阻断剂或PAP笔（疏水屏障笔）在每张组织切片周围画圈，以限制液体扩散的区域。注意墨水不要接触到切片本身。在尽可能靠近每个组织切片的位置画出一个圆圈，但不要接触组织，以最小化需要被杂交溶液覆盖的表面积。
   2. 配制杂交溶液：每50 µL预热的杂交溶液中加入0.5 µg探针（例如，0.5 µL的1 µg/µL探针）。用移液器将杂交溶液滴加到载玻片上的切片上（约20 µL/切片，具体用量取决于切片/圆圈大小）。从这一步开始，在孵育和储存过程中需避免杂交溶液和载玻片暴露于光照下。
   3. 确保所用液体体积在覆盖柔性塑料盖玻片后能够完全覆盖整个切片。将载玻片放入湿盒中孵育，以减少蒸发。可通过在移液器吸头盒底部放置浸透了过量杂交溶液或磷酸盐缓冲盐水（PBS）的擦拭纸或纸巾来制作湿盒。根据探针组合的不同，将切片在45–50 °C下孵育>3 h。
   4. 在孵育期间，将FISH洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；0.9 M NaCl）预热至50 °C。准备足量的洗涤缓冲液以完全浸没Coplin染色缸中的载玻片。
   5. 移除塑料盖玻片；将载玻片和已预热至50 °C的FISH洗涤缓冲液一同放入Coplin染色缸中。将Coplin染色缸放回50 °C的烘箱中孵育10–20分钟。对于较厚的样品，可在Coplin染色缸中加入缓冲液后轻轻剥离盖玻片，以避免切片被拖拽或涂抹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柯普林罐	Fisher	08-813E
盖玻片，22 × 22 mm，1号	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	重悬至5 mg/mL
空移液枪头盒			用于熔化石蜡
FISH探针
FISH杂交溶液	--	--	含20 mM Tris–HCl（pH 7.4）、0.9 M NaCl、0.01% (w/v) SDS的无核酸酶水溶液；可选添加5–50% (v/v) 甲酰胺
FISH洗涤缓冲液	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
荧光标记的欧洲白荆豆凝集素（UEA-1）	Vector Laboratories	FL-1061（荧光素标记）或 RL-1062-2（罗丹明标记）	UEA-1可标记岩藻糖基化聚糖，因此不适用于无菌小鼠或岩藻糖基转移酶2（FUT2）缺陷型宿主的样本。
镊子
HybriSlip柔性塑料盖玻片，22 × 22 mm × 0.25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	用于FISH杂交步骤，可用玻璃盖玻片替代
ImmEdge疏水屏障PAP笔	Vector Laboratories	H-4000
吸水纸（Kimwipes）
多功能标本储存容器，473 mL	Fisher	14-955-117A	可用任意玻璃或聚乙烯容器替代。甲醇-氯仿-冰乙酸（Methacarn）溶液不可与聚苯乙烯或金属容器兼容。
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	任意指甲油均可使用
烘箱			所需温度范围：45–60 °C
PBS，磷酸盐缓冲盐水（10倍浓缩液）	Fisher	BP3991	使用时稀释至1倍浓度
氯化钠	Fisher	S271
Trizma盐酸溶液，1M Tris-HCl，pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
无核酸酶水	Fisher	BP2484100