来源： Jung, A. L., 等. Legionella pneumophila 外膜囊泡：分离及其对巨噬细胞促炎潜能的分析。J. Vis. Exp. (2017)
本视频演示了利用连续离心、无菌过滤和超速离心从Legionella pneumophila中分离外膜囊泡（OMVs）的方法。纯化后的OMVs富含膜蛋白和脂多糖，适用于宿主-病原体相互作用研究。
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方法文章
基于超速离心的分离方法 嗜肺军团菌 外膜囊泡
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2026年1月30日
本文内容
摘要
方案
1. 培养 Legionella pneumophila
- 铺展 L. pneumophila 菌株Corby（野生型，WT）接种于缓冲活性炭酵母提取物（BCYE）琼脂平板，37 °C培养3天。取10 mL酵母提取物肉汤（YEB），调节OD600 0.3 L. pneumophila 从预培养平板中取菌，于37 °C、150 rpm摇床中振荡培养6小时。
- 通过将100 µL悬浮液涂布于血琼脂平板上，验证液体培养物的纯度。37 °C下孵育过夜。
- 将剩余的液体培养物加入90 mL新鲜YEB培养基中，在旋转摇床中培养（37 °C，150 rpm），直至达到OD600 pH 3.0-3.5，大约需要 16-20 小时。
2. 准备并定量 L. pneumophila 外膜囊泡（OMVs）
注意：所有以下离心步骤均须在无菌条件下且于 4 °C 进行。
- 将液体培养物在 4,000 × g 条件下离心 20 分钟，以沉淀细菌。将上清液转移至新的离心管中，弃去细菌沉淀，并重复离心（4,000 × g，20 分钟）。此步骤重复一次。
- 将剩余的上清液用滤膜（孔径：0.22 µm）无菌过滤两次。将去除了细菌的上清液转移至超速离心管中，在 100,000 × g 条件下超速离心 3 小时。
- 倾去上清液并弃去。将外膜囊泡（OMV）沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 100,000 × g 条件下超速离心 3 小时，以去除污染的蛋白质和脂多糖（LPS）。
- 弃去上清液，将 OMV 沉淀重悬于 500 µL 无菌 PBS 中。取 20 µL 分别划线接种于血琼脂平板和 BCYE 琼脂平板，以排除所制备囊泡中的细菌污染。将血琼脂平板在 37 °C 培养过夜，BCYE 琼脂平板在 37 °C 培养 3 天。
注意：通常 100 mL 的 L. pneumophila 培养物可获得约 1 µg/µL 的 OMV。将制备并定量后的 OMV 储存于 -20 °C。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
| 70 Ti 转子 | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
| 比色皿 | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
| Heracell 240i CO₂ 培养箱 | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
| 接种环 | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
| L. pneumophila Corby | --- | --- | |
| PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
| 旋转摇床（MaxQ 6000） | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
| Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
| 无菌滤器（孔径：0.22 µm） | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
| 活性炭 | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
| 琼脂，Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG(Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
| 含 5% 羊血的哥伦比亚琼脂 | Becton Dickinson GmbH(Heidelberg, Germany) | 254005 | |
| 酵母提取物 | Carl Roth GmbH & Co KG(Karlsruhe, Germany) | 2363.2 |
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