秀丽隐杆线虫相关细菌的分离与培养

摘要

来源：Petersen, C. et. al., 模式线虫Caenorhabditis elegans天然微生物群的分离与表征。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）相关的细菌物种的分离与培养方法。通过基于微珠的秀丽隐杆线虫（C. elegans）裂解，结合选择性培养，可实现多种微生物菌株的分离，以便进一步分析。

方案

1. 线虫相关细菌的分离与培养（图1）

1. 为分离细菌，准备一个96孔板，每孔加入三颗无菌的1 mm珠子和20 µL M9最低培养基盐溶液（M9缓冲液），然后用移液器将单个已清洗的线虫转移至各孔中，尽量减少液体的带入。
   注意：也可选择用M9缓冲液将线虫群体从培养板上冲洗下来，并将约300 µL含线虫的M9缓冲液转移至含有10–15颗珠子的2 mL离心管中。
2. 使用珠磨均质器（例如，在30 Hz条件下珠磨3分钟）破碎线虫。短暂离心96孔板或离心管，使液体沉降至底部（例如，在室温下以8000 × g 离心10秒）。
   注意：采用该方法所分离出的细菌类群与16S核糖体DNA（rDNA）扩增子测序结果相似，表明所述珠磨处理可使大多数细菌细胞保持完整。
3. 收集上清液，按1:10比例进行系列稀释，并将最多100 µL稀释液涂布于9 cm的琼脂平板上。
   1. 为确保大多数细菌能够被培养，应使用多种不同营养成分的替代培养基，包括稀释的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA，1:10稀释）、麦康凯琼脂、沙氏葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂或酵母蛋白胨葡萄糖琼脂。
4. 将平板置于采样地点的平均温度条件下（例如，温带地区为15–20 °C）培养24–48小时。
5. 采用标准三区划线法，使用无菌接种环获得纯细菌培养物（图1）。
   1. 使用无菌接种环或牙签从平板上挑取单个菌落，并将其划线接种至新的琼脂平板上，新平板所含琼脂培养基应与纯化时使用的相同。注意仅使用平板约1/3的面积。
   2. 使用新的无菌接种环，或对可重复使用的接种环进行灭菌后，将其穿过第一区划线区域，在同一平板的另外约1/3区域进行第二区划线。
   3. 再次使用无菌接种环穿过第二区划线区域，进行第三区划线。
   4. 在与分离时相同的生长条件下培养平板。该技术应使单个菌落在第三区划线区域形成。
      注意：由于自然分离株倾向于形成生物膜和/或聚集体，可能需要多次重复纯化步骤。
6. 将纯菌落在液体培养基（与琼脂培养基类型相同）中培养，培养温度和时间与上述步骤1.4相同。

结果

图1：物种鉴定与单个细菌的分离。 使用珠磨匀浆器破碎单个线虫，提取DNA用于物种鉴定 通过 PCR 或测序。或者，将破碎的线虫样品进行连续稀释后涂布于培养基平板上。将平板培养至出现细菌菌落，挑取单菌落划线接种至新的平板以获得纯培养物。挑取纯培养物的单菌落用于培养液体细菌培养物，进而制备细菌保存液，于 -80 °C 长期保存。