分离含胞内细菌群落的小鼠膀胱上皮细胞

摘要

来源：Yang, E., et al．从尿路感染小鼠模型中分离用于下游单细胞分析的单个胞内细菌群落．J. Vis. Exp. （2019）

本视频展示了利用口控微量移液技术，从受感染小鼠膀胱中手动分离含有胞内细菌群落的单个上皮细胞的方法，从而实现对尿路感染模型中与宿主相关的可存活 E. coli 群体进行下游的单细胞分析。 

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1．胞内细菌群落（IBC）的分离：用移液管吸取 IBC

注意：本节所述所有方法均已通过机构风险评估。口吸移液具有吸入所转移溶液的固有风险。由于本方案采用纳升级别的体积，该风险已大幅降低。我们建议所有使用者严格遵守本文及讨论部分列出的各项预防措施和操作提示。

1. 将细胞刮入 PBS（磷酸盐缓冲盐水）后，组装口控微量移液装置（图 1C）。
   1. 将拉制好的玻璃毛细管较粗的一端（未拉制端）插入移液器管的橡胶塞（白色端）中。
   2. 将 1 mL 吸头的窄端插入移液器管另一端的开口（红色端），确保紧密贴合。
   3. 将 2 mL 吸液移液管的窄端插入 1 mL 吸头的开放宽端，同样确保紧密贴合。
      注意： 此组装方式使研究人员可通过吸液移液管的宽口端进行口吸，从而在装置另一端的毛细管窄端产生轻柔的负压。
   4. 使用盛有新鲜去离子水的 100 mm 培养皿测试最终的口控微量移液装置。轻微吸气（类似于用吸管饮水）应使毛细管内的液面上升，但不应导致去离子水溢入移液器管中。用一只手控制毛细管，另一只手调节培养皿的位置。
      注意： 不同研究人员在口吸单个 IBC 时所需的吸力强度可能不同。建议初次尝试该技术的研究人员从弱吸力开始，若无液体上升，再缓慢增加吸力。吸力无需超过饮用时用吸管吸液的力度。若在步骤 1.1.4 的测试中毛细管未能吸入液体，可能是毛细管或吸液管堵塞，需更换。此外，建议所有新手研究人员先使用无菌水练习控制口控移液装置的吸力。还需注意，口控移液装置吸取液体体积的控制依赖于研究人员的舌头。舌头可精细调节施加的吸力强度，并可作为紧急停止机制。
   5. 成功吸入液体后，通过轻轻向吸液移液管的开口端吹气，测试从毛细管中排出液体的能力。确保排液过程中不产生气泡，以防止在步骤 1.5 中污染 IBC。
      注意： 与吸力类似，研究人员施加正压将 IBC 排入离心管的力度因人而异。建议初次使用本方案的研究人员在实际感染前数天练习步骤 1.1。一种练习口控微量移液的方法是：使用口控微量移液装置，练习转移少量无菌水与数滴食用染料（便于观察）的混合液。
2. 将刮取的细胞悬液置于解剖显微镜下，识别 IBC 为较大的荧光聚集体（图 1A、B）。推荐放大倍数范围为 20–40 倍。将玻璃毛细管的细端浸入新鲜 PBS 管中 1 秒，以减少毛细作用导致的非预期液体吸入。
3. 在显微镜下观察，定位目标 IBC，并缓慢将毛细管开口端移向 IBC。使用玻璃毛细管的细端扫开 IBC 周围的额外细胞，防止吸入两个或多个细胞，或用于打散较大的细胞聚集体。
4. 在显微镜下观察的同时，对口控微量移液装置远端（吸液移液管）施加极轻微的负压，引导 IBC 进入玻璃毛细管。
5. 吸取 IBC 后，将毛细管移至一个空的 1.5 mL 离心管中，施加轻微正压，将液滴和 IBC 排入离心管（图 1D）。
6. 在处理下一个膀胱前，根据当前膀胱所需数量重复步骤 1.3–1.6。频繁更换吸液移液管和毛细管，以防止唾液积聚。
   注意： 操作具有感染性（或临床）菌株时，需持续监控毛细管内液体水平。切勿让被移取的液体从毛细管边缘溢入移液器管中。若发生溢出，应立即更换移液器管，并丢弃原有装置。
7. 在所有收获的膀胱上重复步骤 1.2–1.6，或直至实验组获得足够数量的生物样本。
8. （可选）重复步骤 1.6 和 1.7，直至所有实验组（或小鼠）均完成安乐死，并从每组收获足够数量的生物样本。

结果

图1：从膀胱细胞中收获IBC。（A）感染后倒置的膀胱置于冷PBS溶液中，准备进行细胞刮取。（B）显微镜下观察到的刮取后的膀胱细胞图像。两个图像中的IBC均可识别为较大的绿色荧光聚集体（见红色箭头所示）。（C）完整的口控...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 结核菌素注射器	BD Biosciences	302100
吸液移液管	BD Biosciences	357558
吸液管	Sigma-Aldrich	A5177
显微镜用数码相机	Olympus	DP71	用于IBC图像采集与收获。任何配备GFP通道的荧光显微镜均可满足需求
玻璃毛细管	Kimax	6148K07
虹膜剪 STR SS 110MM	Braun	BC110R
显微镜光源装置	Olympus	LG-PS2	用于IBC图像采集与收获。任何配备GFP通道的荧光显微镜均可满足需求
宏观荧光显微镜	Olympus	MVX10	用于IBC图像采集与收获。任何配备GFP通道的荧光显微镜均可满足需求
微量移液器及移液器吸头			用于静态细菌培养及OD测定
PBS（磷酸盐缓冲液）1x			用于静态细菌培养及OD测定
聚乙烯管	BD Intramedic	427401
Sterilin 90 mm 标准培养皿	Thermo	101VR20	任何无菌培养皿均可
Stevens 血管与肌腱剪，弯型，精细，110 mm	Braun	OK366R	推荐用于膀胱组织的采集
手术剪 STR S/B 105MM	Braun	BC320R
台式离心机	Eppendorf	5810R	任何可容纳15 ml锥形管的制冷离心机均可