含有细胞内细菌群落的小鼠膀胱上皮细胞分离

摘要

来源： Yang， E. 等。从尿路感染小鼠模型中分离出单细胞内细菌群落，用于下游单细胞分析。 J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了通过口腔微移液法手工分离含有细胞内细菌群落的单个上皮细胞，从而实现尿路感染模型中可存活的宿主相关 大肠杆菌 群体的下游单细胞分析。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审查。

1.细胞内细菌群落（IBC）分离：IBCs的口腔管输送

注意： 本节所述的所有方法均经过机构风险评估。口式移液固有风险，容易摄入所转移的溶液。该协议使用的纳升体积在很大程度上降低了这一风险，我们建议所有协议用户遵守此处及讨论中列出的预防和实践注意事项。

1. 细胞被刮入PBS（磷酸盐缓冲盐水）后，建立口腔微量移液装置（见图1C）。
   1. 将拉出的玻璃毛细管较粗的一端（未拉出的一端）插入吸气管的橡胶塞（白色端）。
   2. 将1毫升移液器尖端的窄端插入吸液管另一端（红色）处，确保紧密配合。
   3. 将2 mL吸液管的窄端插入1 mL移液器尖端的较宽开口端，确保紧密配合。
      注意： 该装置允许研究人员从吸吸移液器较宽且开放的末端吸取，从而从设备另一端毛细管的窄端产生温和的吸力。
   4. 使用装有新鲜去离子水的100毫米培养皿测试最终口腔微量移液装置。吸气吸管开口施加轻微吸力（类似通过吸管啜饮饮料）应增加毛细管内液体的浓度，但不会导致去离子水溢入吸气管。一只手控制毛细管，另一只手调整培养皿的位置。
      注意： 不同研究者对单个IBC进行口吸管吸附所需的吸力强度有所不同。不过，建议每位尝试此技术的研究者从微弱的吸力开始，如果毛细血管内没有液体流动，则逐渐增加吸力。喝水时不需要比吸管更大的力量。如果在步骤1.1.4的测试中毛细管似乎没有吸取液体，可能是毛细管或吸气管被堵塞，需要更换。还建议所有新研究人员首先练习使用消毒水控制口腔移液装置的吸力。此外，口腔移液装置所吸收的体积控制是通过研究者的舌头实现的。舌头可以精细调节吸入力，同时也能作为紧急停止。
   5. 液体成功摄取后，通过轻轻吹气吸入吸管的开口端，测试液体从毛细血管中排出的能力。确保在排液过程中不产生气泡，以防止IBC在第1.5步被污染。
      注意： 与吸力类似，研究人员将IBC排出离心管所施加的正压强度因研究者而异。建议新加入该方案的研究人员在实际感染前几天练习第1.1步。练习口腔微量移液的一个建议是，使用口腔微量移液器练习将少量消毒水混合几滴食用色素（以提高可见性）进行转移。
2. 将刮除的细胞悬浮液置于解剖显微镜下，识别IBCs为大型荧光聚集体（图1A，B）。理想的放大倍率范围是20-40倍。将玻璃毛细管的细端浸入一管新的PBS管中1秒，以减少毛细作用带来的多余体积吸收。
3. 通过显微镜观察，识别感兴趣的IBC，然后慢慢将毛细管的开口端靠近IBC。利用玻璃毛细管的细端扫除每个IBC附近的多余细胞，以防止两个或多个细胞的吸入，或分解较大的细胞聚集体。
4. 在通过显微镜观察时，对口腔微量移液装置远端（吸吸移液器）施加极小的吸力，引导IBC进入玻璃毛细管。
5. 拾取IBC后，将毛细管移至空的1.5毫升离心管，施加轻微正压，将液滴和IBC排出至离心管内（见图1D）。
6. 在当前膀胱需要的IBC数量上重复步骤1.3-1.6，然后再进行下一个膀胱。请经常更换吸吸管和毛细管，以防止唾液积聚。
   注意： 在处理感染性（或临床）细菌菌株时，应持续监测毛细血管中的溶液浓度。不要让被移液的液体液位从毛细管边缘溢出进入吸气管。如果出现这种情况，立即更换吸气管，丢弃之前的设置。
7. 对所有采集的膀胱重复步骤1.2-1.6，或直到采集到足够数量的生物样本供实验组使用。
8. （可选）重复步骤1.6和1.7，直到所有实验组（或小鼠）都被安乐死，并且从每个组收集到足够的生物样本。

结果

图1：从膀胱细胞中采集IBC。 （A）在细胞刮除前，膀胱在冷的PBS溶液中感染且倒置。（B）显微镜下刮擦膀胱细胞的图像。IBCs在两张图像中均可识别为大型绿色荧光聚集体（见红色箭头）。（C）完成的口腔微移液装置图像。吸液移液器、移液器尖端、吸液管和拉动毛细管均以右侧编号箭头标识。（D）一张1.5 mL收集管内单个分离IBC的图像（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1毫升结核菌素注射器	BD生物科学	302100
吸液移液器	BD生物科学	357558
吸气管	西格玛-奥尔德里奇	A5177
显微镜用数码相机	奥林匹斯	DP71	用于图像采集和IBC采集。任何其他带有GFP通道的荧光显微镜都可以
玻璃毛细管	Kimax	6148K07
Iris 剪刀 STR SS 110MM	布劳恩	BC110R
显微镜用光源单元	奥林匹斯	LG-PS2	用于图像采集和IBC采集。任何其他带有GFP通道的荧光显微镜都可以
宏观荧光显微镜	奥林匹斯	MVX10	用于图像采集和IBC采集。任何其他带有GFP通道的荧光显微镜都可以
微量移液器+微量移液器头			用于静态细菌培养和OD测量
PBS（磷酸盐盐水）1次			用于静态细菌培养和OD测量
聚乙烯管	BD 内科医务员	427401
Sterilin 90毫米标准培养皿	热力学	101VR20	任何无菌培养皿
史蒂文斯，血管与肌腱剪刀，弯曲，细致，110毫米	布劳恩	OK366R	推荐用于膀胱采集
外科剪刀 STR S/B 105毫米	布劳恩	BC320R
桌面离心机	埃彭多夫	5810R	任何冷藏离心机，适用于15ml锥形机