检测细菌感染小鼠脑组织中靶基因的表达

摘要

来源： 张，S. 等颅内蛛网膜下腔感染途径用于研究作用 猪链球菌 小鼠感染模型中脑膜炎的生物膜研究 视频实验杂志 (2018).

本视频展示了在感染细菌的小鼠脑组织中检测目标基因表达的方法。首先提取RNA，经DNA降解酶处理后，反转录为cDNA。随后使用基因特异性引物通过热循环扩增cDNA，同时DNA结合染料与扩增产物结合并发出荧光。通过分析荧光信号，确认目标基因的存在。

方案

1. 细菌的制备

注意：Streptococcus suis（S. suis）2型强毒株P1/7分离自一头患脑膜炎的病猪。P1/7菌株在Todd-Hewitt液体培养基（THB，每升THB配方：心浸液，3.1 g；新月蛋白胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g）中培养，并接种于Todd-Hewitt琼脂平板（THA，每升THA配方：心浸液，3.1 g；新月蛋白胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g；琼脂，15.0 g），于37 °C、5% CO₂条件下培养。

1. 收集浮游状态的P1/7菌株细胞
   1. 从对数中期培养物（OD₆₀₀=0.6）中收集5 mL浮游细胞，于8000 × g离心3分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。
   2. 用5 mL含25%甘油的THB重悬细胞，分装至5个管中，于-80 °C保存。
2. 收集生物膜状态的P1/7菌株细胞
   1. 取20 mL过夜培养物加入180 mL新鲜THB中；将稀释后的培养物等分为10份，分别加入圆形培养皿中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养24小时。
   2. 培养结束后，轻轻振荡培养皿以重悬未贴壁的细菌，然后通过抽吸弃去上清液。
      注意：应轻柔振荡，避免重新悬浮已形成的沉淀。
   3. 加入5 mL PBS以收获生物膜状态的细胞，充分重悬沉淀，然后将样品转移至新管中。
   4. 对上一步获得的生物膜状态细胞进行超声处理，参数如下：60 W，4个循环，工作5秒，间歇10秒。
   5. 于8000 × g离心3分钟，将上清液在-80 °C保存。
      注意：上清液可能含有生物膜组分，可用于动物实验（步骤2）中感染前重悬生物膜细菌。
   6. 用10 mL含25%甘油的THB重悬沉淀，将生物膜状态细胞于-80 °C保存。

2. 动物实验

1. 本研究使用6周龄雌性BALB/c小鼠。所有小鼠均通过颅内蛛网膜下腔途径感染，注射位点位于前囟前方3.5 mm处。
   1. 进行组织病理学分析时，使用浮游态细胞或生物膜态细胞以3 × 10⁷菌落形成单位（CFU）的剂量分别感染两组小鼠（每组5只），另设5只小鼠注射PBS作为对照组。
   2. 为检测脑组织中TLR2和细胞因子的mRNA表达水平，额外使用浮游态细胞或生物膜态细胞以3 × 10⁷ CFU的剂量分别感染两组小鼠（每组6只）。
   3. 通过将系列稀释液接种至THA培养基上，测定活菌数量。
   4. 所有小鼠在感染后12小时处死，用于后续研究。​
      注意：感染前必须去除保存菌液中的甘油。从-80 °C取出的浮游态细胞和生物膜态细胞均需用PBS洗涤3次。随后，将浮游态细胞用PBS重悬并稀释至适当感染剂量；生物膜态细胞则使用步骤1.2.5中保存的上清液重悬，并稀释至适当感染剂量。感染体积不应超过50 µL。
2. 检测脑组织中TLR2和细胞因子的mRNA表达
   1. 使用RNA提取试剂盒从脑组织中提取总RNA。
      1. 每只小鼠使用全脑组织提取RNA。将全脑组织分成5管，每管取不超过100 mg脑组织，加入1 mL裂解液及试剂盒提供的裂解基质。
      2. 在匀浆器中以6.0档位处理40秒，然后在12000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
      3. 离心后，将上清液转移至新的微量离心管中。
      4. 将转移后的样品在室温孵育5分钟；加入300 µL氯仿，涡旋振荡10秒，再于室温孵育5分钟。
      5. 在12000 × g、4 °C条件下离心5分钟，将上清液转移至新管中。
      6. 加入500 µL预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀5次，然后在-20 °C保存至少1小时。
      7. 在12000 × g、4 °C条件下离心15分钟，弃去上清液。用500 µL预冷的75%乙醇（溶于无RNase水（H₂O）中）洗涤沉淀。
      8. 去除乙醇后，在室温下空气干燥沉淀5分钟，并将RNA重悬于100 µL无RNase的H₂O中。
      9. 在室温孵育RNA 5分钟，使用RNA生物分析仪测定RNA浓度。
   2. 使用逆转录（RT）试剂盒和热循环仪进行互补DNA（cDNA）合成，包括基因组DNA（gDNA）的去除。
      1. 在离心管中加入1 µg RNA、2 µL 5x gDNA去除缓冲液、1 µL gDNA去除酶，并用无RNase的H₂O补足至10 µL总体积。在42 °C孵育2分钟。
      2. 向上述反应液中加入10 µL预混液（含1 µL RT酶混合液I、1 µL RT引物混合液、4 µL 5x Buffer 2和4 µL无RNase的H₂O），轻轻混匀。立即进行逆转录反应：37 °C 15分钟，随后85 °C 5秒。
      3. 使用SYBR RT-qPCR试剂盒和实时荧光定量PCR仪进行定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析。每反应体系包括：10 µL 2x酶液、0.8 µL正向引物、0.8 µL反向引物、0.4 µL 50x ROX Reference Dye II、2 µL cDNA模板，并用无RNase的H₂O补足至20 µL总体积。
      4. 每个样本设三个复孔，运行以下热循环程序：94 °C 30秒；随后40个循环（95 °C 5秒，60 °C 34秒）；最后进行熔解曲线分析（95 °C 15秒，60 °C 1分钟，95 °C 15秒）。RT-qPCR所用引物列于表1。内参基因为B2m和18s rRNA。
   3. 根据2^-ΔΔCt法计算相对表达倍数变化。

表1：RT-qPCR引物。

引物名称	序列 (5’-3’)	基因符号
IL-6 正向引物	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
IL-6 反向引物	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 正向引物	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
TLR2 反向引物	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
CCL2 正向引物	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 反向引物	ACTACAGCTTCTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α 正向引物	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
TNF-α 反向引物	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	Tnf
β2m 正向引物	GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT	B2m
β2m 反向引物	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18s 正向引物	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18s 反向引物	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
托德-休伊特肉汤（THB）	Becton, Dickinson and Company	DF0492078	将30 g粉末溶解于1 L纯化水中，121°下高压灭菌15分钟。
琼脂	DSBIO	16C0050	将15 g粉末溶解于1 L THB中，121°下高压灭菌15分钟。
Milli-Q Reference 水纯化系统	Merck KGaA	Z00QSVCUS	不含Dnase/Rnase
NaCl	天津科密欧化学试剂有限公司	10019318
Na₂HPO₄	西陇科学股份有限公司	9009012-01-09
KCl	西陇科学股份有限公司	9009017-01-09
KH₂PO₄	西陇科学股份有限公司	9009019-01-09
KOH	西陇科学股份有限公司	9009014-01-09
甘油	西陇化学试剂有限公司	10010618	用等体积纯化水稀释，121°下高压灭菌15分钟
4% 多聚甲醛	西陇化学试剂有限公司	80096675
25% 戊二醛	西陇化学试剂有限公司	30092436	用纯化水10倍稀释用于固定。
乙醇	西陇化学试剂有限公司	10009218
氯仿	西陇化学试剂有限公司	10006818
分光光度计	DeNovix Inc.	DS-11+
超声波细胞破碎仪	宁波新芝生物科技股份有限公司	JY96-IIN
离心机	日立工机株式会社	CT15RE
冰箱	澳柯玛股份有限公司	DW-86L500
FastRNA Pro Green 试剂盒	MP Biomedicals	#6045-050
FastPrep-24 仪器	MP Biomedicals	116005500
PCR 仪器	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	宝日医生物技术（北京）有限公司	RR820A
含gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒	宝日医生物技术（北京）有限公司	RR047A