检测细菌感染小鼠脑组织中靶基因的表达

摘要

来源： 张，S. 等颅内蛛网膜下腔感染途径用于研究作用 猪链球菌 小鼠感染模型中脑膜炎的生物膜研究 视频实验杂志 (2018).

本视频展示了在感染细菌的小鼠脑组织中检测目标基因表达的方法。首先提取RNA，经DNA降解酶处理后，反转录为cDNA。随后使用基因特异性引物通过热循环扩增cDNA，同时DNA结合染料与扩增产物结合并发出荧光。通过分析荧光信号，确认目标基因的存在。

方案

1. 细菌的制备

注意：Streptococcus suis（S. suis）2型强毒株P1/7分离自一头患脑膜炎的病猪。P1/7菌株在Todd-Hewitt液体培养基（THB，每升THB配方：心浸液，3.1 g；新月蛋白胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g）中培养，并接种于Todd-Hewitt琼脂平板（THA，每升THA配方：心浸液，3.1 g；新月蛋白胨，20.0 g；葡萄糖，2.0 g；氯化钠，2.0 g；磷酸氢二钠，0.4 g；碳酸钠，2.5 g；琼脂，15.0 g），于37 °C、5% CO₂条件下培养。

1. 收集浮游状态的P1/7菌株细胞
   1. 从对数中期培养物（OD₆₀₀=0.6）中收集5 mL浮游细胞，于8000 × g离心3分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。
   2. 用5 mL含25%甘油的THB重悬细胞，分装至5个管中，于-80 °C保存。
2. 收集生物膜状态的P1/7菌株细胞
   1. 取20 mL过夜培养物加入180 mL新鲜THB中；将稀释后的培养物等分为10份，分别加入圆形培养皿中，置于37 °C、5% CO_2<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
托德-休伊特肉汤（THB）	Becton, Dickinson and Company	DF0492078	将30 g粉末溶解于1 L纯化水中，121°下高压灭菌15分钟。
琼脂	DSBIO	16C0050	将15 g粉末溶解于1 L THB中，121°下高压灭菌15分钟。
Milli-Q Reference 水纯化系统	Merck KGaA	Z00QSVCUS	不含Dnase/Rnase
NaCl	天津科密欧化学试剂有限公司	10019318
Na₂HPO₄	西陇科学股份有限公司	9009012-01-09
KCl	西陇科学股份有限公司	9009017-01-09
KH₂PO₄	西陇科学股份有限公司	9009019-01-09
KOH	西陇科学股份有限公司	9009014-01-09
甘油	西陇化学试剂有限公司	10010618	用等体积纯化水稀释，121°下高压灭菌15分钟
4% 多聚甲醛	西陇化学试剂有限公司	80096675
25% 戊二醛	西陇化学试剂有限公司	30092436	用纯化水10倍稀释用于固定。
乙醇	西陇化学试剂有限公司	10009218
氯仿	西陇化学试剂有限公司	10006818
分光光度计	DeNovix Inc.	DS-11+
超声波细胞破碎仪	宁波新芝生物科技股份有限公司	JY96-IIN
离心机	日立工机株式会社	CT15RE
冰箱	澳柯玛股份有限公司	DW-86L500
FastRNA Pro Green 试剂盒	MP Biomedicals	#6045-050
FastPrep-24 仪器	MP Biomedicals	116005500
PCR 仪器	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	宝日医生物技术（北京）有限公司	RR820A
含gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒	宝日医生物技术（北京）有限公司	RR047A