气溶胶递送 结核分枝杆菌 用于小鼠模型中肺部感染的研究

摘要

来源：Mueller, A., 等．一种研究结核病与疟疾共感染的实验模型：基于Mycobacterium tuberculosis和Plasmodium berghei自然传播条件下的研究．J. Vis. Exp. （2014）

本视频展示了使用基于雾化器的暴露舱系统将结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis (Mtb)）以气溶胶形式递送至小鼠，以诱导肺部感染，从而建立一种可控且可重复的动物模型，用于在活体条件下研究结核病的空气传播机制以及宿主与病原体之间的相互作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 使用Glas-Col气溶胶感染舱对小鼠进行结核分枝杆菌（Mtb）气溶胶感染

对实验动物进行气溶胶感染时，标准化接种结核分枝杆菌（Mtb，Mycobacterium tuberculosis）的最佳方法是使用已知CFU（菌落形成单位）滴度的冻存菌种。制备菌种储备液时，需将Mtb在添加OADC（油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶）增补剂和0.05%吐温-80（作为分枝杆菌的碳源）的Middlebrook 7H9液体培养基中培养，同时采取措施防止细菌聚集。收获菌液时，培养物的OD（光密度）应≤1。当OD值过高时，细菌聚集增加，活力下降。将1 ml分装菌液于-80 °C保存。通过将三个独立冻存管的菌液进行10倍系列稀释，取样接种于添加0.5%甘油、1 g/L天冬酰胺和OADC的7H11琼脂平板，在37 °C培养4周后计数菌落，以确定冻存菌液中的活菌CFU数量。随后按以下所述方法进行气溶胶感染。

1. 解冻已知CFU滴度的Mtb菌种，使用带27 G针头的1 ml注射器将菌悬液轻轻吹打混匀5次，以分散细菌团块。避免产生气溶胶。
2. 根据所需感染剂量，将适量的分枝杆菌菌液转移至含有6 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的50 ml离心管中。

注意：通过改变该悬液中微生物的数量，可改变携带气溶胶液滴的细菌比例。我们通常希望每只小鼠肺部感染约100个具有活力的杆菌（低剂量感染）。根据我们的经验，这需要在总体积为6 ml的悬液中，含有大约1-2 × 10⁶ Mtb/ml，其中5.5 ml被雾化。建议进行一系列不同细菌浓度的实验性气溶胶攻击，以确定适合您感染实验的理想条件。虽然可通过高达5,000个分枝杆菌的高剂量感染来加速感染进程，但仅用5个细菌也可通过气溶胶成功感染小鼠。感染率通常为100%。

3. 取出足够体积的菌液（制备时应超过所需的最终体积），用于涂布以确定接种物滴度；我们通常取出 500 µl 进行技术重复三份的涂布。
4. 将动物放入圆形气溶胶室内的分隔式金属网篮中（每篮一只小鼠），然后关闭气溶胶室的盖子。

注意： 其他型号配备了一个由五个独立隔间组成的扇形篮，每个隔间可容纳 20 只小鼠。

5. 将文丘里雾化器单元连接到三个不锈钢套管接头上。
6. 使用配有18 G钝针的10 ml注射器从50 ml离心管中取出分枝杆菌悬液，并将注射器置于密闭转运盒中送至气溶胶舱。
7. 取下雾化器单元的螺帽，小心地将分枝杆菌悬液注入雾化器中，避免产生气溶胶。将注射器丢弃至含有2% Buraton的锐器盒中。用螺帽密封雾化器。
8. 打开主电源开关和紫外灯。控制面板显示屏上将显示“Glas-Col Apparatus Co”。
9. 打开程序开关，显示屏将显示“雾化器是否准备就绪？”“篮筐是否已装载？”准备就绪后按“Enter”键。按下Enter键。
10. 显示屏显示“输入预热时间 900”；表示焚烧炉（用于净化排气空气）的预热时间为900秒。按Enter键。
11. 显示屏将显示“输入雾化时间 1,800”；表示默认雾化时间为1,800秒。如需延长雾化时间，输入“2,400”后按Enter键。

注意：在雾化过程中，加压空气将悬浮液雾化，从而产生含有分枝杆菌的微小气溶胶液滴。这些液滴（大小约为 2-5 µm）随主气流进入气溶胶室。

 

12. 显示屏将显示“输入 C.D. 时间 1,800”；这表示衰减周期为 1,800 秒。将其设置为“2,400”，然后按 Enter 键。

注意： 在此循环期间，气溶胶室中在雾化循环期间积聚的气溶胶会逐渐衰减。微小液滴会被实验动物吸入。

13. 显示屏将显示“Enter Dec Time 900”；这表示紫外线消毒循环将持续900秒。按下回车键。仪器将开始依次进行预热、雾化、气溶胶衰减和紫外线消毒过程。
    注意：真空流量计应指示为60立方英尺/小时（在预热循环开始时检查；必要时调节真空控制阀），压缩空气流量计应指示为10立方英尺/小时（在雾化循环开始时检查；相应调节空气控制阀）。
14. 当循环完成后，键盘将显示“Process Complete – Remove Specimen”。关闭程序、紫外线开关以及主电源开关。
15. 检查分枝杆菌悬液是否已完全雾化，若未完全雾化，使用配备18 G钝头针头的适当注射器小心吸取残留液体并记录体积。残留体积不应超过1 ml。
16. 从接头处取下雾化器，将其放入盛有2%布罗托（Buraton）的容器中，至少浸泡2小时，通常过夜消毒。之后将雾化器转移至新的干净容器中，用清水彻底冲洗。让雾化器自然晾干。
17. 打开气溶胶室，将动物放回笼具中。将篮子装入高压灭菌袋中并进行高压灭菌。用2%布罗托（Buraton）擦拭气溶胶室内表面，使其清洁。

注意： 出于安全考虑，进行此操作时应佩戴动力送风式呼吸器。

18. 使用剩余的500 µl分枝杆菌悬液（参见步骤1.3），将技术重复三次（3 × 100 µl）的10倍系列稀释液涂布于7H11琼脂平板上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
布腊通	舒尔克		活性成分：醛类（甲醛、戊二醛、乙二醛、己醛）
Middlebrook 7H9	西格玛	M0178	用于结核分枝杆菌液体培养
Middlebrook 7H11	BD 生物科学	283810	结核分枝杆菌培养用琼脂培养基
Midlebrook OADC 增菌培养基	BD 生物科学	212240	添加至 7H9 和 7H11 中用于结核分枝杆菌培养
吸入暴露系统	Glas-Col
文丘里雾化器	Glas-Col