小鼠细菌感染的生物发光成像

摘要

来源：de Vries, C. R., et al., 一种迟发接种的慢性Pseudomonas aeruginosa伤口感染模型。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种生物发光成像技术，用于监测活体小鼠模型中细菌感染的进展。携带 luxABCDE 报告系统的致病菌可在感染部位发光，从而实现对代谢活跃细菌的可视化。通过随时间对小鼠进行成像，研究人员能够无创地追踪感染动态，并量化生物发光信号强度。

方案

1. 细菌的制备与培养

1. 根据研究人员所在机构的生物安全委员会和动物使用委员会指南，对P. aeruginosa和动物实验采取BSL-2级防护措施。所有涉及P. aeruginosa的操作步骤（包括小鼠接种）均须在生物安全柜中进行。
2. 发光型PAO1:lux菌株的P. aeruginosa可应要求从本实验室获取。将保存于冻存甘油菌种中的PAO1菌株划线接种于Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上。对于发光型PAO1:lux菌株，LB琼脂中应添加选择性抗生素（100 µg/mL羧苄西林和12.5 µg/mL卡那霉素）。在37 °C细菌培养箱中过夜培养。
3. 挑取单个孤立菌落，于3 ml LB液体培养基（pH 7.4）中在37 °C下过夜培养。对于发光菌株，培养基中应添加100 µg/mL羧苄西林。在振荡、有氧条件下培养。

2. 实验步骤准备

1. 所有进行手术的人员均需穿戴洁净的手术袍/实验服、口罩、头套和手套。
2. 对所有手术器械（包括剪刀和镊子）进行高压灭菌。在动物间操作时，采用无菌技术对器械进行消毒。
3. 用乙醇清洁手术台，并准备洁净的手术区域。

3. 脱毛

1. 使用1%–3%异氟烷麻醉8–12周龄的C57BL/6J小鼠。使用异氟烷时，研究人员应遵循所在机构兽医人员关于麻醉的指导原则。
   1. 通过输送1%–3%异氟烷开始麻醉，并将氧气流速调节至1.5 L/min。将小鼠放入诱导室中。
   2. 轻捏小鼠脚趾以评估麻醉深度。当小鼠对刺激不再有反应时，将其从诱导室中取出，并将其置于手术台上，鼻部置于异氟烷鼻罩中。
   3. 在两只眼睛上涂抹眼用润滑剂。
2. 称量小鼠体重，以获得术前基线体重。
3. 将小鼠置于俯卧位。在两侧 flank 处皮下注射预热的无菌0.9%氯化钠溶液，每侧250 µL，共500 µL。
4. 使用电动剃毛器剃除小鼠背部区域的毛发。剃毛操作应在与手术区域不同的位置进行，以防止毛发污染伤口。
5. 涂抹一层薄薄的脱毛乳液。让乳液停留20–60秒。用温水浸湿的纱布擦去毛发和多余的乳液。脱毛完成后，立即进行创伤性伤口切除操作。

4. 全层切除性伤口手术

1. 使用25 G针头在小鼠背部中线区域皮下注射缓释布托啡诺0.6–1 mg/kg。缓释布托啡诺可在48–72 h内提供镇痛作用。
2. 消毒手术部位。用无菌碘伏棉签擦拭背部表面，再用无菌酒精棉签擦去多余碘伏。此步骤应重复3次（交替使用碘伏和酒精），从中心向外周呈环形擦拭。让该区域自然晾干。
3. 使用无菌纱布或塑料保鲜膜在手术部位周围创建无菌铺巾。
4. 向尾侧拉紧皮肤。使用无菌6 mm直径皮肤活检打孔器，在左侧背部表皮上制作初始切口。在右侧背部表皮重复此操作。
5. 用镊子从左侧标记伤口区域的中心将皮肤提起呈 tent 状。用剪刀切除表皮层和真皮层。在右侧标记伤口区域重复此操作，以制备对称的切除性伤口。
6. 用50 µL无菌生理盐水清洗伤口。让手术部位及周围皮肤自然晾干。然后用透明薄膜敷料覆盖伤口及背部。
7. 将小鼠放回清洁的笼子中。每笼单独饲养1只动物。
8. 将笼子放在加热垫上，并持续监测直至小鼠苏醒。
9. 对多只动物进行上述手术时，应在每只动物之间使用高温珠灭菌器对所有手术器械进行消毒。
10. 让小鼠术后恢复24 h，使伤口表面形成临时性伤口基质，然后再进行细菌接种。

5. 接种P. aeruginosa

1. 将过夜培养的PAO1:lux菌液用含100 µg/mL羧苄青霉素的75 mL LB培养基稀释至OD600 = 0.05，并培养细菌至对数早期（OD₆₀₀ ≈ 0.3）。此过程大约需要 2–3 小时。
2. 将PAO1:lux用PBS稀释至浓度为(7.5 ± 2.5) x 10² CFU/mL。务必制备过量的接种物，以确保有足够的体积，并为实验后涂布平板留出余量。若需在不同场所间转运（例如从实验室到动物房），应使用双层密闭容器，并置于标明“生物危害”的防漏箱中。
3. 所有操作均需在 P. aeruginosa 在动物生物安全二级（ABSL-2）认证的生物安全柜（BSC）中，使用经批准的个人防护装备进行操作，并对天平等可重复使用设备用保鲜膜包裹，以防止污染。
4. 使用3%异氟烷按上述方法进行麻醉。称量小鼠并记录体重。在小鼠两侧 flank 皮下注射预热的无菌0.9%氯化钠溶液，每侧250 µL，总量为500 µL。
5. 如果小鼠的透明敷料在过夜后脱落，应小心去除由此形成的结痂，并更换新的敷料。
6. 使用500 µL结核菌素27 G带安全帽注射器，通过透明薄膜敷料将40 µL PAO1:lux悬液注入每个伤口。为防止对侧交叉污染，非接种/PBS伤口对照应使用不同的小鼠。
7. 将小鼠放回笼中，置于加热垫上，并监测直至其苏醒。所有小鼠应单独饲养在不同的笼具中，以防止交叉污染。
8. 在笼底将高热量营养补充剂膏体夹在食物颗粒之间提供。
9. 使用剩余的接种物划线接种于LB琼脂平板。通过菌落计数以确认给予的细菌数量。

6. 体内成像感染伤口

1. 在将小鼠运送至成像仪器及从仪器运回时，遵循BSL-2防护规程，包括使用次级容器。在将小鼠转移至诱导室或成像仪器过程中，注意避免转移或洒落任何动物垫料。
2. 在诱导室中使用吸入式1%–3%异氟烷对小鼠进行麻醉诱导。
3. 小鼠麻醉后，将其俯卧位放置于光学成像系统的成像室中，并将鼻部置于异氟烷鼻罩内。
4. 打开软件程序。
5. 采集参数将根据同时成像的小鼠数量和生物发光强度而变化。需设置的基本参数包括曝光时间、binning、光圈值（f/stop）和视野（FOV）。我们默认的初始设置为：曝光时间30秒、binning低（2）、光圈值1.2、视野25。根据研究人员的具体需求，可相应调整这些参数。
6. 使用成像软件分析发光数据。发光信号将以伪彩图像形式叠加在小鼠的彩色照片上显示。
   1. 在伤口部位创建感兴趣区域（ROI），测量检测到的平均通量（光子/秒）。注意，数据也可表示为辐亮度（光子/秒/cm²/球面度），但只要成像平台与相机之间的距离在各次成像中保持恒定，使用通量即可满足要求。
   2. 在成像平台上随机选择一个区域创建ROI，测量背景值，并从检测信号中减去该区域的光子/秒数值。
   3. 将数据导出至电子表格以进行进一步分析。
7. 按照上述方法，可每日进行成像以追踪感染进展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液	Hospira	2484457
18 G × 1 无菌针头	BD	305195
25 G × 1 1/5 无菌针头	BD	305127
酒精棉片	BD	326895
Aura 成像软件	Spectral Instruments Imaging	n/a
聚维酮碘（Betadine）	Purdue Frederick Company	19-065534
缓释型布托啡诺 SR LAB	Zoopharm	n/a
C57BL/6J 雄性小鼠	The Jackson Laboratory	664
一次性活检打孔器，6 mm	Integra	33-36
精细剪刀 - 碳化钨	Fine Science Tools	14568-09
玻璃珠干热灭菌器	Harvard Apparatus	61-0183
颗粒状琼脂	Fisher BioReagents	BP9744
加热垫	Milliard	804879481218
带 28 G 针头的胰岛素注射器	BD	329461
Lago X 成像系统	Spectral Instruments Imaging	n/a
LB 肉汤培养基	Fisher BioReagents	BP1426
1 mL 鲁尔锁注射器	BD	309628
Mini Arco 动物毛发修剪器	Wahl Professional	919152
含婴儿油的 Nair 脱毛乳液	Church and Dwight	n/a	可在任意药房购买
八角镊	Fine Science Tools	11041-08
培养皿	Falcon	351029
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-040-CV
Press and Seal 保鲜膜	Glad	n/a
带 30 G 针头的安全型胰岛素注射器	BD	305934
安全型胰岛素注射器，1/2 mL，30 G × 5/16 TW	BD	305934
电子天平	Ohaus Scout Pro	SP202
Supplical 营养补充剂	Henry Schein Animal Health	29908
Tegaderm 敷料，6 cm × 7 cm	3M	1624W