共渗透实验用于筛选抑制植物RNA沉默的病原效应子

摘要

来源：Shi, J., et al. 从植物病原菌分泌效应子中筛选和鉴定RNA沉默抑制因子. J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了一种共渗透测定法，用于鉴定在Nicotiana benthamiana 16c中抑制RNA沉默的病原体效应蛋白。通过Agrobacterium将荧光报告基因和候选效应基因导入植物叶片。正常情况下，RNA沉默会降解报告基因的转录本，从而减弱荧光信号。而具有抑制功能的效应蛋白可阻断这一反应，使荧光得以保留。该测定方法提供了一种快速、直观的手段，用于筛选干扰宿主防御反应的微生物效应蛋白。

方案

共注射 Nicotiana benthamiana叶片

1. 等体积混合 农杆菌 含有35S-GFP的培养物 农杆菌 含有35S- 黄瓜花叶病毒抑制子2b（CMV2b）、假定效应子或空载体（EV）的菌液。
2. 在叶片的远轴面小心且缓慢地注入混合的农杆菌悬浮液 N. benthamiana 使用1 mL无针注射器对16c叶片进行处理。
3. 用软纸巾从叶片上除去残留的细菌悬浮液，并用记号笔圈出侵染区域的边缘。
4. 将已接种的植株置于相同的生长条件下，在培养室中继续培养。
   
   注意： 出于安全与健康考虑，渗透过程中应佩戴护目镜和口罩。为防止交叉污染，每次渗透之间应更换手套或用乙醇进行消毒。通常每片叶片渗透需要至少1 mL农杆菌悬浮液。对于系统性沉默实验，至少需要对两片叶片进行渗透。

材料

本文使用的材料清单

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