从蚊子中肠分离细菌

摘要

来源：Liu, X., et al. 使用抗生素处理蚊子的细菌口服饲喂实验。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了蚊子中肠的解剖过程，以分离肠道细菌。从中肠消化道中取出中肠组织，经匀浆处理释放细菌，随后接种于营养琼脂平板上培养细菌菌落。

方案

1. 解剖蚊子中肠
   1. 将表面消毒的蚊子转移至载玻片上的一滴无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，在解剖显微镜下进行解剖。
   2. 在解剖显微镜的低倍镜下，小心去除蚊子的足、翅和头部，以防其移动；通过直接剪断而非拉扯的方式去除蚊子的最后一节体节，以避免消化道断裂。
   3. 用镊子夹住蚊子的胸部和腹部末端，轻轻拉出其消化道。所获得的消化道通常包含嗉囊、前肠、中肠、后肠以及马尔皮基氏管。
   4. 将解剖显微镜调至较高倍率，从已解剖的消化道中去除嗉囊、前肠、后肠和马尔皮基氏管，从而获得蚊子的中肠。
   5. 去除嗉囊时需格外小心，因为蚊子摄取糖餐后，嗉囊会膨胀并形似中肠。马尔皮基氏管是一组细长的排泄管，位于中肠与后肠交界处。
2. 分离肠道细菌
   1. 将解剖得到的中肠转移至含有200 µL无菌1×PBS缓冲液的无菌1.5 mL离心管中。
   2. 在无菌操作台中使用无菌研杵充分研磨中肠，使肠道细菌完全释放到缓冲液中。
   3. 将匀浆液进行连续10倍梯度稀释，共稀释三步。取每种稀释液各50 µL接种于LB（Luria broth）琼脂平板上，并涂布均匀。若中肠中含有较高浓度的肠道菌群，则必须进行更多梯度稀释，以便获得单菌落。
   4. 将平板置于37 °C培养1–2天，直至可见单菌落。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aedes aegypti			雌性蚊子
离心管	Sangon Biotech	F601620-0010	1.5 mL，无色，带刻度，无菌
一次性组织研磨杵	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm 长，锥形，蓝色，无菌
镊子	RWD	F11029	解剖用
LB 琼脂粉	Sangon Biotech	A507003	胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂 15.0 g。
显微镜	Zeiss	Stemi508
10X PBS 缓冲液	Sangon Biotech	E607016	本产品为 10X 溶液，使用前需稀释 10 倍。pH 值为 7.4。