活体成像斑马鱼胚胎中巨噬细胞在分枝杆菌感染过程中的细胞死亡

摘要

来源：Niu, L., et al. 通过活体显微镜观察结核分枝杆菌感染期间斑马鱼胚胎中巨噬细胞的溶细胞性死亡。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用活体共聚焦显微镜观察斑马鱼胚胎中巨噬细胞裂解性细胞死亡的过程 Mycobacterium marinum 感染

方案

1. 感染过程的活体成像

1. 1. 活体成像用鱼类固定
   1. 将最多10条经三卡因麻醉的胚胎转移至玻璃底35 mm培养皿中央。弃去多余的E3培养基。
   2. 用1%低熔点琼脂糖覆盖培养皿，并使用10号针头小心调整斑马鱼胚胎的方向。将玻璃底培养皿置于冰上孵育10秒，使琼脂糖凝固。
      注意：进行中脑注射时，应将胚胎在琼脂糖中头部朝上固定（图1A）。
   3. 待琼脂糖完全凝固后，覆盖一层卵水（含1×三卡因和PTU（N-苯基硫脲））。
2. 三色高分辨率延时共聚焦显微成像
   注意：以下步骤在配备63.0×1.40油镜紫外物镜的共聚焦显微镜上操作。
   1. 将环境室温度设置为28.5 °C。在室内放置湿润的纸巾以提供湿度，防止卵水蒸发。
   2. 将装有斑马鱼的35 mm玻璃底培养皿放入环境室中。
   3. 打开共聚焦软件并初始化载物台。切换至63.0×1.40油镜紫外物镜，使用微分干涉差（DIC）滤光片的明场通道定位斑马鱼。
   4. 打开405二极管、氩气（20%功率）和DPSS 561 nm激光器。设置适当的激光功率和光谱参数。
      注意：以下为Cerulean（激发波长 = 405 nm；发射波长 ≈ 456–499 nm）、eGFP（激发波长 = 488 nm；发射波长 ≈ 500–550 nm）、DsRed2（激发波长 = 561 nm；发射波长 ≈ 575–645 nm）的光谱设置
   5. 选择“XYZ”“逐帧扫描”采集模式，并将图像格式设为“512 × 512像素”。
   6. 切换至“实时数据模式”。定位第一条斑马鱼的位置，并标记Z轴的“开始”和“结束”位置。对剩余每个胚胎重复此过程。可在程序末尾添加“暂停”。
   7. 定义程序的循环次数和周期。
   8. 保存文件。 

结果

图1：为活体成像固定斑马鱼胚胎。 （A）进行中脑感染时，将斑马鱼胚胎头部朝下固定。（B）进行躯干区域感染时，将斑马鱼胚胎侧向固定，使注射部位靠近玻璃底培养皿的底部。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
琼脂糖	Sangon Biotech	A60015
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5 II
环境培养箱	Pecon	Temp control 37-2 digital
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-苯基硫脲（PTU）	Sigma	P7629