新生小鼠脾脏吞噬细胞体外杀菌活性评估

摘要

来源：Seman, B. G., 等. 革兰氏阴性菌败血症的新生儿成像模型. J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了从新生小鼠脾脏中分离中性粒细胞和炎性单核细胞，并将其应用于发光细菌杀伤实验的方法。内容涵盖机械解离、红细胞裂解、基于磁珠的细胞富集、细菌孵育以及抗生素保护等步骤。定时检测发光信号可反映细菌的初始内化过程及随后由免疫细胞介导的清除作用。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 体外细菌杀伤实验

1. 取一只未感染的新生幼鼠的脾脏，放入无菌60 mm培养皿中的40 µm尼龙筛网内。重复此操作，将多个脾脏汇集至同一管中，共同收获并均质化处理。
2. 加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS），并补充10%胎牛血清（FBS）。
3. 使用无菌3 mL注射器活塞充分研磨组织，直至形成单细胞悬液。
4. 收集尼龙筛网外的单细胞悬液，转移至15 mL离心管中，在350 x g条件下离心5分钟，沉淀细胞。
5. 用红细胞裂解缓冲液重悬细胞（每7–8个脾脏使用2 mL），室温静置5分钟以去除红细胞。
6. 用PBS洗涤脾细胞，并按上述方法离心收集细胞沉淀。
7. 根据预期细胞产量，将脾细胞重悬于0.25 mL PBS中，PBS中含0.5% BSA和2 mM EDTA。
8. 使用血细胞计数板或其他合适的方法对脾细胞进行计数。
9. 利用免疫磁珠分离Ly6B.2⁺细胞（粒细胞/炎症性单核细胞为主的髓系细胞群）。
10. 将Ly6B.2⁺细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于黑色或白色96孔板中，每孔体积为0.1 mL，培养基为含10% FBS、2 mM谷氨酰胺和25 mM HEPES的DMEM（完全培养基）。
11. 对生物发光的E. coli进行计数，并在最终体积为0.1 mL的条件下配制所需感染复数（MOI）的细菌接种液。建议将所有孔在相同MOI下所需菌液批量配制，以保证一致性。
12. 每孔加入0.1 mL细菌接种液，对照孔仅加入完全培养基。将多孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
13. 孵育结束后，用移液器轻轻吸去原有培养基，更换为含庆大霉素（100 µg/mL）的新鲜完全培养基0.2 mL，每次使用新的枪头。将细胞继续孵育2小时。
14. 感染后3小时，使用酶标仪从带盖培养板底部检测每孔的发光值，随后将培养板重新放回培养箱继续孵育。
15. 在其他所需时间点重复进行发光值的检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACK裂解缓冲液	Gibco	LSA1049201	细菌清除实验
Anti-Ly-6B.2 微珠	Miltenyi Biotec	130-100-781	细胞分离
Escherichia coli O1:K1:H7-lux（表达荧光素酶）	不适用	不适用	由西弗吉尼亚大学（WVU）自主构建
分离缓冲液	Miltenyi Biotec	不适用	细菌清除实验
LB肉汤，Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	细菌培养
EASYstrainer（尼龙滤网）	Greiner Bio-one	542 040	细胞滤筛
SpectraMax iD3	Molecular Devices	不适用	酶标仪