使用包被的生物发光细菌建立新生小鼠感染模型

摘要

来源：Seman, B. G., et al. 一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿成像模型。J. Vis. Exp. (2020)

该视频展示了一种利用包被的生物发光细菌研究新生小鼠全身性感染的动物模型。将高剂量或低剂量的细菌悬液注射至新生乳鼠体内，随后将其放回母鼠身边以接受产后护理。包被的细菌可逃避早期免疫系统的识别，进而发生全身性扩散，并可通过生物发光成像技术随时间推移进行可视化观察。该模型可实现对新生小鼠感染进展的无创追踪。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 细菌接种物的制备

1. 使用接种环在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上划线，从稳定表达荧光素酶并具有卡那霉素抗性的 Escherichia coli O1:K1:H7-lux 冻存菌种中分离单个菌落。于 37 °C 培养过夜。
2. 次日，在生物安全柜中将LB（Luria肉汤）恢复至室温（25 °C）。
3. 在生物安全柜内，挑取划线平板上的单个菌落，接种至3 mL含有卡那霉素（30 μg/mL）的LB培养基中。于37 °C、220 转/分钟（rpm）振荡条件下培养过夜。此为起始培养物。
4. 在生物安全柜内，将起始培养物按1:100比例稀释至新鲜的3 mL LB培养基（含卡那霉素30 μg/mL）中，并于37 °C、220 rpm振荡条件下继续培养2–3小时。此即为工作菌液（stock culture）。
5. 使用分光光度计在600 nm波长下测定空白对照和工作菌液的光密度（OD）。取100 µL不含细菌的LB培养基加入96孔平底检测板的一个孔中作为空白对照；另取100 µL工作菌液加入另一孔中。每组设置两个额外重复。使用酶标仪读取吸光度值。
6. 从工作菌液的吸光度值中减去空白对照的吸光度值（即OD值），并与先前建立并验证过的生长曲线进行比对，以估算工作菌液中的细菌浓度，用于确定感染剂量。
7. 根据研究目的制备目标接种量。本研究中使用的小鼠感染剂量分别为每只 2 × 10⁶（低剂量）和 7 × 10⁶（高剂量）菌落形成单位（CFUs）/小鼠。
   1. 将每只小鼠的目标剂量（DoseT）除以工作菌液中估算的细菌浓度（Stock），得到所需从原菌液管中取出的菌液体积（VS）。
   2. 将VS乘以需感染的小鼠数量（NM），并额外增加5–10份备用剂量，以计算感染所需的总菌液体积。从原菌液管中取出该体积的菌液，转移至新的离心管中。
   3. 使用以下公式：DoseT / Stock = VS × NM = 需从原菌液管中取出的总菌液体积（VT）。
8. 将细菌在4 °C条件下以2,000 × g离心5分钟，然后将菌体沉淀重悬于每只待感染小鼠50 µL的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2–7.6）中（例如，若需制备10份、每份含2 × 10⁶细菌的接种液，则应将含2 × 10⁷细菌的菌体沉淀重悬于500 μL PBS中）。建议制备的接种液量略多于实际所需。同时准备等体积的纯PBS作为对照组接种液。将感染用接种液和PBS对照液置于冰上保存，直至使用。
9. 在96孔塑料底稀释板中用PBS进行七次十倍系列稀释，取各稀释液25 μL，每个稀释度设两个重复，点种于添加卡那霉素（30 μg/mL）的四分区TSA平板上，用于准确计数实际给予的细菌数量。于37 °C培养过夜，待菌落形成后进行计数。

2. 动物识别

1. 准备足够数量的繁殖配对，以便同步产仔，获得年龄匹配的幼鼠。年龄差异在±1天范围内是可接受的。
2. 确定一只怀孕的C57BL/6雌性小鼠，并在计划实验前密切监测其分娩情况，以准确确定幼鼠年龄。
3. 为区分对照组和感染组的3日龄或4日龄幼鼠，仅对对照组幼鼠使用一对小型精细尖头虹膜剪剪去尾尖。感染组幼鼠不进行剪尾操作。剪尾前，用浸有70%乙醇的棉球对皮肤进行消毒。根据需要，用棉球或纱布按压尾部末端。
   注意：该操作应在生物安全柜内进行。剪去约1/8英寸长度的尾尖即可。
4. 为在对照组和感染组内部进一步区分个体幼鼠，使用带有28 G × ½″永久性针头的1 mL胰岛素注射器对幼鼠尾巴进行纹身标记。纹身前，用浸有70%乙醇的棉球对皮肤进行消毒。该操作应在生物安全柜内进行。
5. 进行尾部纹身时，先将动物纹身墨水涂于针尖。然后，用一只手小心固定幼鼠，使其尾部完全暴露。轻柔地将针头刺入皮下，保持较浅的深度，沿皮肤平行移动数毫米，形成一个小标记或点状痕迹。在缓慢拔出针头前等待数秒钟，以避免墨水从皮下过多渗出。
6. 根据需要，用棉球或纱布对伤口施加压力。用70%乙醇擦去皮肤表面多余的纹身墨水。
7. 对感染组和对照组中的后续幼鼠重复此过程，每处理一只幼鼠即增加一个点（例如，1号幼鼠尾部有1个点，2号幼鼠尾部有2个点，依此类推）。
   注意：为增加识别层级，建议对照组和感染组分别使用不同颜色的动物纹身墨水。

3. 肩胛下接种

注意： 本研究共进行了两次实验，每次实验均设立低剂量组和高剂量组。在第一次实验中，7只幼鼠接受低剂量接种（其中4只作为对照），另取一窝中的5只幼鼠接受高剂量接种（其中3只作为对照）。实验1的幼鼠仅提供24小时时间点的数据。在第二次实验中，8只幼鼠接受低剂量接种（其中2只作为对照），6只幼鼠接受高剂量接种（其中2只作为对照）。实验2的幼鼠提供了0、10和24小时时间点的数据。

1. 选择出生不超过1天的幼鼠进行年龄匹配。将每窝幼鼠随机分配为低剂量组或高剂量组。在每窝内，再随机将幼鼠分配为对照组或感染组。
2. 出生后第3或第4天，在接种E. coli-lux或PBS对照物之前，记录所有幼鼠的体重。在此期间将母鼠与幼鼠分离，以确保接种过程中幼鼠不会被移动。
3. 在生物安全柜内，使用胰岛素针头吸取PBS或E. coli-lux接种液。本研究中，每只小鼠接种剂量分别为2 × 10⁶和7 × 10⁶ CFU。接种液和PBS均需在冰上保存，直至通过皮下注射方式给予。
4. 将新生幼鼠置于生物安全柜内的清洁表面上，提起其颈部背侧皮肤，模拟抓握幼鼠颈部皮肤的动作。
5. 在皮肤与肌肉之间形成的空隙处，将针头斜面向上插入，仅进入皮下，然后注射50 µL的PBS或E. coli-lux。同时松开捏起的皮肤，以防止注射液回流。
6. 缓慢而小心地拔出针头。注射完成后，将幼鼠放回母鼠身边。注意：由于出生第3至4天的新生幼鼠在解剖发育阶段上的限制，尾静脉注射或腹腔注射在技术上具有挑战性。因此，本研究选择肩胛下注射途径，因其操作简便。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 胰岛素注射器	Coviden	1188128012	接种物或 PBS 注射
动物纹身墨膏	Ketchum	KI1482039	动物标识
绿色动物纹身墨膏	Ketchum	KI1471039	动物标识
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux （表达荧光素酶）	N/A	N/A	由西弗吉尼亚大学（WVU）自主构建
DPBS，1X	Corning	21-031-CV
Difco 胰蛋白胨大豆琼脂	Becton, Dickinson and Company	236950	细菌培养
IVIS Spectrum CT 及 Living Image 4.5 软件	Perkin Elmer	N/A	活体成像
LB 肉汤，Lennox 型	Fisher BioReagents	BP1427-500	细菌培养