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小鼠牙龈组织切片中细菌的原位检测

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2026年1月30日

本文内容

摘要

来源：Choi, Y. S., 等。利用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针在石蜡包埋组织中进行细菌原位检测。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了使用地高辛标记的DNA探针靶向细菌DNA，在小鼠牙龈组织切片中进行细菌原位检测的方法。将组织切片与探针孵育后，加入与地高辛特异性结合的碱性磷酸酶偶联抗体。随后灭活内源性磷酸酶，并通过添加底物生成有色沉淀。切片经复染、脱水、二甲苯透明处理后封片，最后通过显微镜观察细菌分布。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 探针制备

  1. 探针的PCR扩增
    1. 对于 牙龈卟啉单胞菌–特异性探针，扩增一段343 bp的DNA片段 P. gingivalis 使用基因组DNA通过PCR扩增16S rRNA P. gingivalis 以及以下引物：5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' 和 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'。扩增反应的循环条件如下：95 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min 20 s，共进行 35 个循环，最后在 72 °C 延伸 5 min。
    2. 使用合成的70 bp DNA片段（5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC-3'）作为真细菌探针，并以下列引物进行扩增：5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' 和 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'。扩增反应的循环条件为：94 °C 变性30 s，60 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min 20 s，共40个循环，最后在72 °C 延伸5 min。
    3. 通过加入3 M醋酸钠（pH 5.2）和100%乙醇（体积比为10:1:2），在-20 °C孵育2小时，使PCR产物（≥500 µl）沉淀。
    4. 在14,000 × g离心15分钟，将沉淀重悬于100 µl Tris-乙二胺四乙酸（EDTA）或TE缓冲液中，并在260 nm处通过光密度测定DNA浓度。
  2. 使用 DIG DNA 标记与检测试剂盒进行地高辛标记
    1. 将3 µg探针与水混合，定容至15 µl。
    2. 在95 °C下使DNA变性10分钟，然后迅速置于冰上冷却。
    3. 向15 µl变性的DNA中加入2 µl 10x六核苷酸混合物、2 µl脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）标记混合物和1 µl Klenow酶。
    4. 混合后于37 °C孵育24至48小时，然后在65 °C加热以终止反应。
  3. 使用 DIG DNA 标记与检测试剂盒检测 DIG 标记探针的灵敏度
    1. 手动将试剂盒中提供的阳性对照探针的系列稀释液各1 µl以及1 ng DIG标记的探针加样至尼龙膜上，室温下干燥5分钟。
    2. 将膜短暂浸泡于2×盐水-柠檬酸钠（SSC）缓冲液（0.3 M氯化钠或NaCl，30 mM柠檬酸钠，pH 7.0）中，随后在80 °C孵育1小时，以固定DNA。
    3. 将膜短暂浸泡于马来酸缓冲液（MAB，0.1 M 马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5）中，随后在室温下用封闭液（试剂盒提供）6 ml 将抗DIG碱性磷酸酶（AP）偶联抗体按1:5,000比例稀释后孵育30分钟。
    4. 用 MABT（含 1% Tween 20 的 MAB）洗涤膜，然后加入 40 µl 硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸盐（NBT/BCIP）溶液与 2 ml 检测缓冲液（0.1 M 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐或 Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.05 M 氯化镁或 MgCl₂）的混合液2，pH 9.5）孵育膜1分钟。如果标记探针的灵敏度不理想，重复步骤1.1.3至1.3.4。
    5. 测量标记探针的DNA浓度（OD260）并将浓度调整至 100 ng µl-1。
  4. 检测地高辛标记探针的特异性
    1. 将来自不同细菌物种的基因组DNA样本（每份样本25 ng，3 µl-1），包括特异性探针靶向的细菌，于95 °C变性10分钟，迅速置于冰上冷却。
    2. 手动将变性的DNA加样至尼龙膜上，在室温下干燥20分钟。
    3. 将膜在2x SSC缓冲液中短暂浸泡，然后在80 °C下孵育2小时，以固定DNA。
    4. 在室温下用封闭液封闭膜 1 小时。
    5. 将探针用杂交缓冲液稀释至1 ng µl-1，变性稀释后的探针，然后将其加至膜上。
    6. 将膜在 45 °C 下孵育 1 小时。
    7. 用2x SSC缓冲液将膜清洗三次。
    8. 将膜短暂浸泡在MAB中。
    9. 在6 ml封闭液中，将抗DIG碱性磷酸酶偶联抗体按1:2,000稀释，室温孵育1小时。
    10. 用 MABT 洗涤膜，然后加入 40 µl NBT/BCIP 溶液与 2 ml 检测缓冲液的混合液。
    11. 当探针未能达到预期的特异性时，应逐步提高杂交温度，直至观察到特异性信号。

2. 原位杂交

注意：为避免样本和试剂干燥，所有孵育步骤均应在加湿的孵育盒中进行，盒内衬以湿润的纸巾。

  1. 组织切片脱蜡与复水
    1. 从石蜡包埋的组织块中制备 4 µm 厚的组织切片。本方案适用于经甲醛、多聚甲醛和锌基固定液固定的样本。
    2. 使用经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水配制所有试剂。
    3. 在60 °C的干燥烘箱中加热载玻片30分钟，然后在室温下孵育载玻片30分钟。
    4. 将载玻片浸入100%二甲苯中，每次5分钟，共三次；每次使用新鲜二甲苯。
      注意：在化学通风橱中进行此脱蜡操作。
    5. 将载玻片浸入100%乙醇中，每次5分钟，重复两次，每次使用新鲜乙醇；随后将样本依次浸入90%、80%和70%乙醇溶液中，每种浓度各5分钟，进行复水处理。
    6. 将载玻片浸入DEPC处理的水中1分钟，随后在DEPC处理的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中清洗6分钟。
  2. 组织切片的预处理
    1. 将载玻片浸入0.1 N盐酸中20分钟，然后用DEPC处理水清洗载玻片30秒。
    2. 使用蜡笔在样本周围绘制疏水屏障。
      注意：疏水屏障的大小取决于样本的尺寸。因此，后续步骤中所用试剂的体积需根据样本大小进行调整，但必须足以填满疏水屏障（小样本为50 µl，大样本为400 µl）。
    3. 用 50 至 400 µl 蛋白酶 K（1 至 10 µg/ml）处理样本-1 在37 °C的干燥烘箱中用DEPC处理的PBS孵育30分钟，然后用DEPC处理的1×PBS洗涤载玻片1分钟。
    4. 将载玻片浸入含4%多聚甲醛的DEPC处理PBS中固定10分钟，随后用DEPC处理PBS洗涤1分钟。
    5. 将载玻片浸入含0.5%乙酸酐的0.1 M三乙醇胺盐酸盐（pH 8.0）溶液中20 min，随后在DEPC处理的水中清洗30 s。
  3. 与探针杂交及洗涤
    1. 将载玻片浸入2x SSC缓冲液中20分钟。
    2. 将探针稀释至 1 ng/µl-1 在杂交缓冲液（4x SSC、50% [体积/体积] 甲酰胺、1x Denhardt 溶液、10% [重量/体积] 硫酸葡聚糖、0.1% [重量/体积] 十二烷基硫酸钠、0.4 mg ml-1 鲑鱼精 DNA）中进行。对于阴性对照，将标记探针与10倍过量的未标记探针混合。
    3. 将稀释的探针变性后，取50至400 µl加至组织切片上。盖上盖玻片，并用指甲油密封。
    4. 在PCR仪中于90 °C加热载玻片10分钟，随后将载玻片置于湿盒中，于45 °C或步骤1.4.11确定的最佳温度下过夜（O/N）孵育。
    5. 将载玻片置于4 °C冷却30分钟，移除盖玻片，随后将载玻片依次浸入SSC缓冲液中：4x SSC中10分钟，预热至45 °C的2x SSC中20分钟，2x SSC中10分钟，以及0.2x SSC中10分钟。
  4. 使用抗DIG-碱性磷酸酶偶联抗体进行检测
    1. 用 MABT 洗涤载玻片 5 分钟。
    2. 用含1% Tween 20的封闭液封闭，体积为50至400 µl，孵育20分钟。
    3. 加入50至400 µl用封闭液按1:1,000稀释的抗DIG-AP抗体，37 °C孵育90分钟。
    4. 用 MABT 清洗载玻片 10 分钟。
    5. 将载玻片浸入含1% Tween 20的检测缓冲液中，5分钟。
    6. 用含有1% Tween 20的检测缓冲液配制的1 mM 左旋咪唑（50至400 µl）处理5分钟，以灭活内源性碱性磷酸酶。
    7. 将50至400 µl预混的NBT/BCIP溶液（用检测缓冲液按1:100稀释）分别加入每个样本，将载玻片置于湿盒中，室温孵育2至3小时，直至显色信号达到满意程度。
    8. 用去离子水冲洗载玻片以终止显色反应，随后在37 °C条件下加入50至400 µl浓度为0.05%（wt/vol）的甲基绿作为复染剂，孵育10分钟。
    9. 用去离子水冲洗载玻片，经100%乙醇脱水后浸入二甲苯中。
    10. 在每张载玻片上加入 80 µl 封片液，并用盖玻片封片。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸酐Sigma6404 
50% 硫酸葡聚糖溶液MilliporeS4030 
50X Denhardt 溶液SigmaD2532 
焦碳酸二乙酯（DEPC）SigmaP159220 
地高辛（DIG）DNA 标记与检测试剂盒Roche11 093 657 910 
甲酰胺SigmaF9037 
ImmEdge™ 笔DakoH-400 
左旋咪唑VectorSP-5000 
氯化镁Sigma246964 
马来酸SigmaM0375 
甲基绿SigmaM6776 
多聚甲醛SigmaP1648 
PermountFisherSP15-500 
鲑鱼精 DNA 溶液Invitrogen#15632-011 
氯化钠SigmaS9625 
柠檬酸钠DuksanD1420 
十二烷基硫酸钠Amresco227 
三乙醇胺-盐酸盐Sigma90279 
Tris-盐酸盐Research organics3098T 

标签

细菌检测DNA探针杂交地高辛标记探针碱性磷酸酶抗体内源性磷酸酶失活NBT/BCIP底物组织脱水封片显微镜下细菌可视化
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