利用生物发光技术在小鼠模型中可视化尿路感染

摘要

来源：Luyts, N., et al. 利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了利用生物发光的E. coli注入膀胱，在小鼠模型中诱导并追踪尿路感染的过程，其中发生细菌黏附、侵入及胞内复制。生物发光操纵子发出的光在感染进展过程中作为细菌载量的实时标记。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物接种

1. 动物的准备
   1. 根据研究问题、基因敲除品系的可获得性、实验细节以及尿路感染（UTI）易感性的差异，选择合适的小鼠品系。需注意，雌性小鼠更易于进行经尿道插管操作。避免使用8周龄以下的动物，因其免疫系统尚未发育成熟。本实验中使用了12周龄的雌性C57Bl/6J小鼠。
   2. 提前订购实验动物，并让其充分适应环境，理想情况下适应7天。将动物分组饲养于独立通风的笼具中，置于标准的12小时光照/12小时黑暗循环条件下。
   3. 剃除动物腹部区域的毛发以减少信号损失。切勿使用脱毛膏，因其可能迅速灼伤动物皮肤。剃毛时，用非惯用手紧握动物颈背部皮肤及后肢以固定动物，同时用惯用手进行剃毛。 Alternatively, shave under isoflurane anesthesia.
      注意： 动物在成像前2天进行剃毛，因为动物会进一步舔舐清理剃毛区域。
   4. 提供水和标准食物 随意摄取 在整个实验过程中，动物可自由饮水。但在灌注前2小时需限制饮水，以尽量减少灌注时的膀胱容积。
   5. 将无菌的24 G套管针头安装在100 µL注射器上，并用细菌溶液充满注射器。
      注意： 为确定背景发光，在滴注前获取基线图像（见下文步骤2）。
2. 动物灌注
   1. 将动物置于诱导室中，使用异氟烷与纯氧作为载气进行吸入麻醉（诱导浓度为3%，维持浓度为1.5%）。
   2. 将一只动物置于操作台面上，呈仰卧位，在滴注过程中通过鼻罩维持稳定的异氟烷麻醉。涂抹眼膏。
   3. 通过在耻骨上区域施加轻柔按压并做环形移动，排出残余尿液。灌注前用70%乙醇清洁下腹部。
   4. 用生理盐水润滑导管尖端。将非优势手的食指置于腹部，轻轻向上推动。以90°角（垂直方向）开始插入尿道导管，当遇到阻力时，将导管转为水平方向，再继续插入0.5 cm。
      注意： 切勿强行推进导管，否则会损伤尿道。轻柔地旋转导管有助于插入。另一方面，若无阻力感，通常提示导管误入阴道。
   5. 以缓慢速度（5 µL/s）向目标部位注入50 µL细菌接种物（2 × 10⁷ 菌落形成单位（CFU）。
      注意： 较大的灌注量或较快的灌注速度可能导致尿液反流至肾脏。在练习该技术时，可使用蓝色墨水来评估反流情况。
   6. 滴注后，将注射器和导管保持原位数秒，然后缓慢撤出，以防止泄漏。记录任何异常情况，如大量泄漏或尿道口出血，并在必要时剔除动物。
   7. 将动物置于成像室鼻罩处的仰卧位，并对所有剩余动物重复上述步骤1.1.1–1.1.6。每个实验组使用一根导管。确保持续麻醉，并尽量缩短第一只与最后一只动物之间的操作时间。
   8. 如有需要，可在成像前或成像后（步骤2）给予抗生素或实验性药物。例如，给予恩诺沙星时，将40 µL恩诺沙星（100 mg/mL）溶液加入3.96 mL生理盐水中，配制成1/100稀释液。于上午9点和下午5点分别按100 µL/10 g体重皮下注射，即每日两次，每次10 mg/kg，连续给药3天。

2. 生物发光成像

1. 成像参数的准备与选择
   1. 打开BLI成像采集软件（见材料表），点击成像设备（见材料表）上的“初始化”以测试相机和载物台控制系统，并将CCD相机冷却至-90 °C。​
      注意：在此过程中，舱门将被锁定，可在控制面板上查看初始化进度。绿灯表示已达到-90 °C的温度。若在初始化完成前尝试成像，系统将发出警告。
   2. 确保数据自动保存：点击采集界面的“自动保存”，并选择正确的保存文件夹。
   3. 选择“发光成像”和“拍照”。检查默认的发光设置：激发滤光片设为“阻断”，发射滤光片设为“开放”。
   4. 首次成像时将曝光时间设为“自动”，尤其是在预期信号较弱的情况下，以确保获得足够的光子计数。对于体内测量和强信号样本，将曝光时间设为约30 s。若图像饱和，系统将发出警告；此时应降低曝光时间。
   5. 选择中等二乘（medium Binning）、光圈F/stop 1，并选择正确的视野（FOV）（5只动物时选D）。
   6. 对小鼠成像时，将样本高度设为1 cm。
   7. 在采集控制面板中点击“添加”三次，以获取三张图像序列作为技术重复。
2. 成像操作
   1. 将小鼠以仰卧位放入成像舱内，并使用多通路鼻罩在整个实验过程中维持麻醉（异氟烷1.5%）。可同时成像最多5只小鼠，并使用遮光挡板分隔动物，防止反射干扰。
   2. 关闭舱门，点击“采集”以启动成像序列。
   3. 填写实验的详细信息（如野生型与基因敲除动物、处理方式、成像日期等）。成像参数（如曝光时间）将自动保存。
   4. 从成像舱中取出小鼠并放回笼具，观察其从麻醉中完全恢复的情况。数分钟内，动物应完全清醒并开始探索环境。无需给予镇痛药物，因其可能干扰尿路感染（UTI）病程。
   5. 将笼具放回通风架，等待下一次成像周期。实验结束后，通过CO₂窒息或颈椎脱位法对动物实施安乐死。操作应在异氟烷麻醉恢复前完成，以最大程度减少动物痛苦。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉蒸发器	Harvard Apparatus Limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
拜耳百灵 100 mg/mL	Bayer	N/A	恩诺沙星
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	黄色套管针，用于滴注时使用无菌塑料针头
C57Bl/6J 小鼠	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R 离心机	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	用于测量 600 nm 处的光密度（OD）
Dulbecco 磷酸盐缓冲液，Gibco 品牌	ThermoFisher Scientific	货号 14040-083
70% 变性乙醇，5 L	VWR International	85825360
Falcon 14 ml 圆底聚苯乙烯管，带 snap-cap 盖	Corning	352057
Falcon 50 ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT 注射器，PTFE 鲁尔锁，100 µL	Sigma-Aldrich	26203	确保以 50 µL 缓慢接种细菌
接种环	Roth	6174.1	手柄：货号 6189.1
Iso-Vet 1000 mg/g	Dechra Veterinary Products	N/A	异氟烷
IVIS Spectrum 活体成像系统	PerkinElmer	货号 124262	成像设备