利用生物发光在小鼠模型中可视化尿路感染

Abstract

来源： Luyts， N. 等。 利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗的纵向随访。 J. Vis. Exp.（2021年）。

本视频演示了利用生物发光大 肠杆 菌注射膀胱，诱导并追踪小鼠模型中的尿路感染，细菌在膀胱中发生粘附、入侵和细胞内复制。生物发光纵子发出的光作为细菌在感染进展过程中的实时标记。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审查。

1. 动物接种

1. 动物的准备
   1. 根据研究问题、敲除系的可用性、实验细节以及尿路感染易感性的差异，选择所需的小鼠品系。请记住，经尿道导管在雌性小鼠中更容易。不要使用8周以下的动物，因为它们免疫发育尚不成熟。这里使用了12周大的雌性C57Bl/6J小鼠。
   2. 提前很久订购动物，让它们适应，最好是7天。将动物单独通风笼养，标准12小时光暗条件下。
   3. 剃净动物腹部，以减少信号丢失。不要使用脱毛膏，因为它会迅速灼伤动物的皮肤。用非惯用手紧握颈背和后肢，同时用惯用手剃须，约束动物。或者，在异氟醚麻醉下剃须。
      注意： 动物在影像检查前两天剃毛，因为动物会进一步梳理剃毛区域。
   4. 在整个 实验过程中， 随时提供水和标准食物。不过，在植入前2小时应停止给动物饮水，以减少膀胱体积。
   5. 将无菌的24克导管尖端装在100微升注射器上，并注入细菌溶液。
      注意： 要确定背景发光，在注入前获取基线图像（见下文步骤2）。
2. 动物的植入
   1. 将动物放入感应舱，并以吸入含纯氧的异氟醚作为载体气体进行麻醉（感应3%，维持吸入1.5%）。
   2. 将一只动物仰卧放在工作台上，并在麻醉过程中使用鼻锥保持稳定的异氟醚麻醉。涂抹眼膏。
   3. 通过轻柔压迫并在耻骨上做圆周运动，排出残留尿液。注入前用70%乙醇清洁下腹部。
   4. 用生理盐水润滑导管尖端。将非惯用手的食指放在腹部，轻轻向上推。从90°垂直角度开始导尿管，遇到阻力后水平倾斜后再插入（0.5厘米）。
      注意： 切勿用力推导尿管，因为这会伤害尿道。轻柔的转动动作有助于导尿管插入。另一方面，缺乏阻力通常表明插入阴道时有误。
   5. 缓慢（5 μL/s）输注50 μL细菌接种剂（2 x 10⁷ CFU）。
      注意： 较大剂量或更快的注射可能导致肾脏反流。在练习该技术时，可以使用蓝色墨水来评估反流。
   6. 插注后，将注射器和导管保持在原位几秒钟，然后慢慢收回以防止渗漏。记录任何异常情况，如大量漏尿或带血尿口，必要时排除动物。
   7. 将动物置于成像腔鼻锥侧的仰卧位置，并对剩余动物重复上述步骤1.1.1-1.1.6。每个实验组使用一根导尿管。确保持续麻醉，并尽量减少第一只动物和最后一只动物之间的时间。
   8. 如有必要，在影像检查前后（步骤2）给予抗生素或实验性药物。例如，给药恩诺沙星时，将40微升恩诺沙星（100 mg/mL）溶液加入3.96毫升生理盐水中，达到1/100稀释度。每天上午9点和下午5点皮下注射100 μL/10 g，注射10 mg/kg的Enrofloxacin，每天两次，持续3天。

2. 生物发光成像

1. 成像参数的制备与选择
   1. 打开BLI采集软件（见材料表），在成像设备中点击初始化（见材料表），测试相机和舞台控制器系统，并将CCD相机冷却至-90°C。
      注意： 在此过程中，门会被锁上，初始化进程可以在控制面板上跟踪。绿灯表示温度已达到-90°C。如果在初始化完成前尝试成像，将会弹出警告。
   2. 确保数据自动保存：点击获取自动保存，选择正确的文件夹。
   3. 选择荧光和摄影。检查默认的发光设置：将激发滤波器设置为“块”，发射滤波器设置为“开启”。
   4. 拍摄第一张照片时，尤其是预期信号较暗时，将曝光时间设置为自动，以确保光子数量充足。 对于体内 测量和明亮信号，将曝光时间设为~30秒。如果图像饱和，会弹出警告。如果发生这种情况，就缩短曝光时间。
   5. 选择中级分区，光圈/档位1，并选择正确的视野（FOV）（D代表5只动物）。
   6. 拍摄小鼠时，将受试者高度设置为1厘米。
   7. 在采集控制面板中点击“添加”三次即可获得三张图像序列，作为技术复制。
2. 成像
   1. 将小鼠仰卧放入成像舱，使用歧管鼻锥维持麻醉（异氟醚1.5%）。同时拍摄最多5只老鼠，并用光挡板分开动物，防止反射。
   2. 关上门，点击获取开始成像序列。
   3. 填写关于实验的详细信息（野生型和基因剔除动物、治疗方法、影像检查当天等）。成像设置，如曝光时间，会自动保存。
   4. 把老鼠从成像舱里取出，放回笼子里。检查麻醉后是否完全恢复。几分钟内，动物们就会完全清醒并开始探索。不要提供止痛药，因为这可能会影响尿路感染的治疗。
   5. 将笼子放回通风架，等待下一次影像周期。实验结束后，通过二氧化碳窒息或颈椎脱位安乐死动物。在异氟醚麻醉恢复前进行此作，以减少疼痛

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻醉蒸发器	哈佛设备有限公司	无	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	拜耳	无	恩诺沙星
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	黄色导管，插管用无菌塑料头
C57Bl/6J鼠标	让维耶	无
离心机5804R	埃彭多夫	EP022628146
Dropsense 16	无拘无束的实验室	特里尼	测量外径600nm
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水，Gibco	热飞世科学	参考号 14040-083
乙醇70%变性5L	VWR国际	85825360
Falcon 14ml 圆底聚苯乙烯管，按扣盖	科宁	352057
Falcon 50ml 细胞起始	格赖纳	227285
汉密尔顿气密封注射器，PTFE鲁尔锁，100微升	西格玛-奥尔德里奇	26203	以确保细菌缓慢注入50微升
接种环	罗斯	6174.1	持有者：艺术。编号6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra兽医产品	无	异氟醚
IVIS光谱体内成像系统	珀金·埃尔默	参考124262	成像设备