制备 农杆菌 植物细胞基因递送的培养方法

摘要

来源：Shi, J., et al., 从植物病原菌分泌效应子中筛选和鉴定RNA沉默抑制因子。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了通过乙酰丁香酮诱导根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）毒力基因表达，制备菌液的实验步骤；随后通过洗涤和重悬去除抗生素，最终获得可用于向植物组织递送基因的转化-ready悬浮液。

方案

1. 准备用于侵染的农杆菌培养物

1. 从LB（Luria-Bertani）平板上挑取一个阳性单菌落，接种至含有5 mL LB培养基的玻璃试管中，LB培养基中添加50 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL利福平。于30 °C、200 rpm振荡条件下培养24−48 h。
2. 取100 µL上述菌液转入5 mL LB培养基中，培养基中添加相同抗生素、10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES；pH 5.6）和20 µM乙酰丁香酮（AS）。于30 °C、200 rpm振荡条件下培养16−20 h。
3. 在4,000 × g 条件下离心10 min。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于2 mL 10 mM MgCl₂缓冲液中。
4. 重复步骤1.3，以确保完全去除抗生素。
5. 通过测定600 nm处的光密度（OD₆₀₀）确定农杆菌（Agrobacterium）菌液的浓度。用10 mM MgCl₂缓冲液将菌液浓度调整至OD₆₀₀为1.5−2.0。
6. 向最终的菌悬液中加入10 mM MES（pH 5.6）和150 µM AS，于室温下静置孵育至少3 h。
   注意：最终菌悬液不可过夜放置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-吗啉乙磺酸 (MES)	Biofroxx	1086GR500	缓冲液
乙酰丁香酮 (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	农杆菌诱导剂
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB 培养基
胰蛋白胨	BD Biosciences	211705	LB 培养基
酵母提取物	BD Biosciences	212750	LB 培养基
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	K1914	抗生素
利福平	MP Biomedicals	219549005	抗生素
氯化钠	Amresco	0241-10KG	LB 培养基