小鼠膀胱组织样本制备以可视化细菌感染

摘要

来源：O'Brien, V. P., 等，小鼠膀胱暴露于Gardnerella vaginalis诱发反复性大肠杆菌尿路感染。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了利用扫描电子显微镜观察在预先感染的小鼠模型膀胱上皮中细菌定植及宿主-病原体相互作用的方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 通过扫描电子显微镜对膀胱进行成像

   注意： 该操作可在需要观察尿路上皮的任意时间点进行。如图所示， 图1 （紫色框），尿路致病性 E. coli (UPEC) 与尿路上皮的相互作用在UPEC接种后6小时至24小时的储菌库形成阶段最为清晰可见，且可观察到由UPEC触发的尿路上皮脱落现象 Gardnerella vaginalis 在第二次处理后的3小时至12小时之间观察效果最佳 G. vaginalis 暴露

   1. 原位 膀胱固定
      1. 在采集膀胱前立即配制固定液：将戊二醛（终浓度2.5%）和多聚甲醛（终浓度2%）加入0.15 M二甲胂酸钠缓冲液中，并含2 mM CaCl₂₂ 在pH 7.4条件下使用。应采用新开封的玻璃安瓿中的多聚甲醛和戊二醛，因为这两种固定剂在容器开启后会随时间发生氧化。​警告： 戊二醛具有毒性，对呼吸道有刺激性，且具有腐蚀性；多聚甲醛易燃，具有致癌性，对皮肤和黏膜有刺激性，且为生殖毒素；二甲胂酸钠有毒且具有致癌性。
      2. 配制约 50 mL 固定液：取 6.25 mL 16% 多聚甲醛、2 mL 50% 戊二醛和 16.75 mL 超纯水，加入 25 mL 0.3 M pH 7.4 含 4 mM CaCl₂ 的二甲胂酸钠溶液中混合₂.
      3. 将制备好的固定剂在使用前加热至 37 °C。
      4. 用固定液填充结核菌素滑动针头注射器，并在末端连接一根导管，使斜面朝向与注射器刻度相反的方向。从针头末端剪去1-2 mm多余的导管，注意不要暴露针尖。轻弹注射器以去除气泡，推动活塞，在微量离心管上方排出空气并用固定液充满导管，以便收集任何溢出的固定液，进行妥善处理。
      5. 使用批准的方法（例如，在麻醉下进行颈椎脱臼）对小鼠实施麻醉和处死。将小鼠置于解剖台面上，用橡皮筋或大头针固定四肢。用镊子和手术剪刀打开小鼠的盆腔区域，暴露膀胱。小心地将邻近的脂肪组织拨开，但保留膀胱原位。
      6. 用惯用手握住注射器，针头朝下，针尖斜面和注射器刻度朝向远离自身的方向。将导管尖端浸入无菌润滑剂中。
      7. 将导管尖端置于小鼠尿道口，手持注射器筒，使其与小鼠身体呈30–45°角。
      8. 使用导管尖端以极轻微的顺时针向下按压动作，轻柔地将导管插入尿道。当导管尖端进入尿道后，在继续将导管向前推进的同时，将注射器向小鼠尾部方向折转，直至注射器筒体与操作台面平行。整个导管针轴（不包括基部）应完全进入小鼠体内，使导管尖端位于膀胱腔内。
      9. 缓慢注入50–80 µL固定液，使膀胱像气球一样膨胀。保持导管位置不变，将注射器略微抬起，针尖向上倾斜。
      10. 用另一只手打开止血钳，将其中一个钳臂滑入导管针下方，位置位于尿道交叉处。部分闭合止血钳，直至其刚好与针接触。
      11. 轻轻将导管针从膀胱中抽出，同时完全夹紧并锁定止血钳，以防止固定液流失。
      12. 用止血钳夹住，使其与工作面平行，膀胱位于其上方。轻轻提起，然后在止血钳下方（膀胱的对侧）小心剪切，以连同止血钳一并移除膀胱。
      13. 将膀胱及附带的止血钳放入含有预热固定液的Falcon管中。确保膀胱完全浸没在液体中，且未紧贴管壁。于4 °C孵育24 h。
   2. 膀胱的扫描电子显微镜（SEM）处理与成像
      1. 用洁净的双面剃须刀片将膀胱沿矢状方向切开，并沿止血钳边缘做第二个切口以释放膀胱。此操作将获得两个半膀胱“杯状”结构。若膀胱外部仍有残留的脂肪组织，应轻柔去除。
      2. 用0.15 M、pH 7.4的二甲胂酸钠缓冲液冲洗膀胱半叶三次，每次10分钟。
      3. 用1%四氧化锇的0.15 M卡考基酸缓冲液在室温下对组织染色1小时。四氧化锇对光敏感，因此染色容器需用铝箔包裹，以保持避光环境。​
         警告： 四氧化锇具有毒性且对皮肤具有腐蚀性。此步骤需在通风橱内戴手套操作。
      4. 将膀胱半叶用超纯水冲洗三次（每次10分钟）。在这些步骤中，有时可在水面看到四氧化锇油状物。应吸除或用滤纸吸去该油状物，以防止在后续干燥步骤中造成污染。
      5. 将组织依次浸入梯度乙醇溶液（50%、70%、90%、100%、100%）中脱水，每级10分钟。
      6. 使用临界点干燥仪干燥固定后的组织，执行12次CO₂置换₂ 以最慢速度进行换液。除排气步骤设为快速外，其余所有附加设置均设为慢速。
      7. 用洁净的双面剃须刀将每个膀胱半片再次对切，共得到4个组织块，以降低样本曲率，便于扫描电镜（SEM）成像，并暴露因干燥过程中可能卷曲的组织。
      8. 将膀胱组织块粘附在铝制载台的导电碳胶带上，用牙签蘸取少量银胶涂抹于底部接触处周围，注意防止过量胶体渗入膀胱内表面。
      9. 使用高真空溅射镀膜仪，将样品台溅射镀上6 nm的铱。如果样品仍存在充电现象，需用银导电漆在表面绘制导电通路，并额外再镀4 nm的铱。
      10. 使用扫描电子显微镜对样品进行成像。尽管成像条件可能因所用显微镜型号而异，但在使用Zeiss Merlin FE-SEM并配备Everhart-Thornley（SE2）电子探测器时，加速电压为3 KeV、束流为200 pA、工作距离为12–13 mm的参数设置效果良好。

结果

图1. 小鼠模型示意图。 时间轴突出显示了本方案中所述模型的各个阶段或操作步骤。第1阶段（橙色）：建立胞内尿路致病性 E. coli (UPEC) 储菌库。通过经尿道接种使小鼠感染UPEC，并采集尿液样本以监测菌尿的清除情况。仅对成功清除细菌的小鼠继续进行后续阶段实验。第2阶段（绿色）：膀胱暴露于 Gardnerella vaginalis。小鼠经尿道接种 G. vaginalis 两次，两次连续暴露之间的时间间隔为12小时（上图）或1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30G × 1/2 针头	BD	305106	用于导管
5 1/2" 直型止血钳	McKesson	487377	膀胱原位固定
ACE 600 溅射镀膜仪	Leica		扫描电镜样品处理
铝制扫描电镜样品台	Ted Pella	16111	扫描电镜样品处理
氯化钙	EMS	12340	膀胱原位固定
导电碳胶粘片	Ted Pella	16084-1	扫描电镜样品处理
导电银漆	Ted Pella	16034	扫描电镜样品处理
CPD 300 临界点干燥仪	Leica		扫描电镜样品处理
Cytofunnel 金属夹	Simport	M964B	尿液细胞离心分析
乙醇	EMS	15050	扫描电镜样品处理
葡萄糖	Sigma	G7528	用于 NYCIII 型阴道加德纳菌培养基
戊二醛	EMS	16320	膀胱原位固定
Hema 3 染色试剂盒	Fisher	23123869	尿液细胞离心分析
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	用于 NYCIII 型阴道加德纳菌培养基
铱	Ted Pella	91120	扫描电镜样品处理
Merlin 场发射扫描电镜	Zeiss		扫描电子显微镜
Milli-Q 超纯水系统	Millipore	IQ-7000	扫描电镜样品处理
四氧化锇	EMS	19170	扫描电镜样品处理
多聚甲醛	EMS	15710	膀胱原位固定
聚乙烯导管	Intramedic	427401	用于导管
蛋白胨 #3	Fisher	DF-122-17-4	用于 NYCIII 型阴道加德纳菌培养基
聚四氟乙烯双刃刀片	EMS	72000	用于扫描电镜膀胱组织切开