用于细菌感染可视化的小鼠膀胱组织制备

Abstract

来源：O'Brien， V. P. 等，《由小鼠膀胱暴露诱发的反复性大肠杆菌尿路感染》。《J. Vis. Exp.》（2020年）

本视频演示了利用扫描电子显微镜观察细菌定殖及宿主-病原体在感染前小鼠模型膀胱上皮中的相互作用。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审查。

1. 扫描电子显微镜成像膀胱

   注意： 该手术可以在任何需要观察尿路上皮的时间点进行。如 图1 （紫色框）所示，尿路病原性 大肠杆菌 （UPEC）与尿路上皮的相互作用最好在UPEC接种后6小时至24小时内观察到的储液形成阶段，而由 Gardnerella vaginalis 引发的尿路皮脱皮则最好在第二次G . vaginalis 暴露后3小时至12小时内观察。

   1. 原位 膀胱固定术
      1. 在膀胱收获前立即准备固定液，加入0.15 M钠二甲酰甲烷（2.5%最终）和2 mM CaCl_2，pH 值为7.4。使用新开封玻璃安瓿中的对甲醛和戊二醛，因为这两种固定剂在开封容器中会随着时间氧化。注意： 戊二醛有毒，具有呼吸刺激物和腐蚀性;对甲醛易燃、致癌、刺激物和生殖毒素;砷酸钠有毒且致癌。
      2. 要制备50毫升固定液，将6.25毫升16%对甲醛、2毫升50%戊二醛和16.75毫升超纯水加入25毫升0.3 M钠砷酸钠溶液，pH 7.4，加4 mM_CaCl2。
      3. 在给药前将预备好的固定剂加热至37°C。
      4. 将固定剂注入结核菌素滑头注射器，并在末端固定导管，斜面对向注射器标记。从针头端1-2毫米处剪掉多余的管子，注意不要露出针尖。轻弹注射器去除气泡，推入活塞至空空气，然后用微型离心管注入定弦液，收集固定剂以便妥善处理。
      5. 使用经批准的方法麻醉并牺牲小鼠（例如麻醉下宫颈脱位）。将老鼠放在解剖面上，腿部用橡皮筋或针固定固定。用镊子和一把手术剪刀打开小鼠的盆腔区域，露出膀胱。小心地推开相邻的脂肪，但保持膀胱原位。
      6. 用惯用手握住注射器，针头朝下，针头斜角和注射器标记朝向你。将导管尖端浸入无菌润滑剂中。
      7. 将导管尖端对准尿道口，将注射器筒以30-45°角对准小鼠身体。
      8. 用导管尖端顺时针微小向下施压，轻柔地将导管插入尿道。当导管尖端进入尿道时，将注射器铰向小鼠尾部，同时继续将导管滑入更深处，直到注射管与工作面平行。整个导管针轴（不含根部）应进入小鼠体内，使导管尖端位于膀胱腔内。
      9. 缓慢注入50-80微升固定液，使膀胱像气球一样膨胀。保持导管位置，稍微抬起注射器，将尖端向上倾斜。
      10. 另一只手打开止血钳，将一根插脚滑入导尿管针下方，位于尿道交叉处。部分关闭止血钳，直到它只接触到针头。
      11. 轻轻将导尿管针从膀胱中抽出，同时夹紧并完全锁定止血钳，以防止固定液流失。
      12. 握住止血钳，使其与工作面平行，膀胱放在上面。轻轻地从止血钳下方（膀胱的另一侧）抬起，取出止血钳，同时止血钳还连着。
      13. 将膀胱和固定止血瓶放入装有温热固定剂的Falcon管中。确保膀胱完全浸没在液体中，而不是压在管壁上。在4°C下孵育24小时。
   2. 利用扫描电子显微镜（SEM）进行膀胱处理与成像
      1. 用清理过的双面剃须刀片矢状切开膀胱，然后在止血钳方向切开第二刀以释放膀胱。这导致了两个半膀胱“杯”。如果膀胱外侧还有残留的脂肪垫，请轻轻取出。
      2. 将膀胱半块用钠龧二甲酸缓冲液（0.15 M，pH 7.4）冲洗三次（每次10分钟）。
      3. 在室温下用0.15 M砷酸锇酯缓冲液中用1%四氧化锇染色1小时。锇对光敏感;因此，应将染色器包裹锡纸以保持暗色环境。​
         注意： 四氧化锇对皮肤有毒且腐蚀性强。戴手套在排气柜里做这个步骤。
      4. 用超纯水冲洗膀胱半块三次（每半10分钟）。在这些步骤中，有时可以看到渗入油在水面上。在干燥过程中，吸入或吸除这些物质以防止污染。
      5. 通过将分级乙醇序列（50%、70%、90%、100%和100%）浸入各10分钟，进行脱水。
      6. 使用临界点干燥机干燥固定组织，以最低速度进行12次_CO2 交换。将所有额外设置设置为减速，除了排气步骤，该步骤设置为快速。
      7. 用干净的双面剃刀将每个膀胱一半再次切开，形成4块，以减少标本弯曲，提高涂层效率，便于SEM成像，并暴露干燥过程中可能弯曲的组织。
      8. 将气囊片粘在铝制短片上的导电碳胶片上，并在牙签底部接触处涂上少量银胶，注意防止多余胶水渗入气囊内表面。
      9. 使用高真空溅射涂层机，在样品残头上涂有6纳米的铱。如果样品继续充电，确保用银色油漆绘制导电路径到表面，并再涂上4纳米的铱。
      10. 用扫描电子显微镜成像样品。虽然条件因显微镜不同而异，但3 KeV的加速电压、200 pA的束流电流和12-13毫米的工作距离在使用Everhart-Thornley（SE2）电子探测器时，在蔡司梅林FE-SEM上表现良好。

Results

图1。鼠标模型示意图。 时间线被高亮显示，以反映协议中模型的阶段或程序。第一阶段（橙色）：建立细胞内泌尿病性 大肠杆菌 （UPEC）储库。小鼠通过尿道接种UPEC疫苗，并采集和监测尿液样本以排除菌尿。只有清除细菌的小鼠进入后续阶段。第二阶段（绿色）：膀胱暴露于 阴道Gardnerella。小鼠会通过尿道接种两次G . vaginalis 。两次连续暴露之间的间隔时间为12小时（上面板）或1周（一周;下面板），具体取决于所需的下游分析。第...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30克 x 1/2针	BD	305106	对于导尿管来说
5 1/2英寸直式产钳止血钳	麦克森	487377	原位膀胱固定术
ACE 600 溅射涂层机	徕卡		SEM样品处理
铝制SEM短头	特德·佩拉	16111	SEM样品处理
氯化钙	急救医疗服务	12340	原位膀胱固定术
导电碳胶片	特德·佩拉	16084-1	SEM样品处理
导电银漆	特德·佩拉	16034	SEM样品处理
CPD 300临界点干燥机	徕卡		SEM样品处理
细胞漏斗金属夹	进口	M964B	细胞旋蛋白尿液分析
乙醇	急救医疗服务	15050	SEM样品处理
葡萄糖	西格玛	G7528	针对NYCIII阴道菌生长培养基
戊二醛	急救医疗服务	16320	原位膀胱固定术
Hema 3染色套件	费舍尔	23123869	细胞旋尿分析
天哪	塞尔格罗	25-060-Cl	针对NYCIII阴道菌生长培养基
铱	特德·佩拉	91120	SEM样品处理
梅林FE-SEM	蔡司		扫描电子显微镜
Milli-Q净水器	米利波尔	IQ-7000	SEM样品处理
四氧化锇	急救医疗服务	19170	SEM样品处理
对甲醛	急救医疗服务	15710	原位膀胱固定术
聚乙烯管	内科医务员	427401	导尿管
蛋白酶 #3	费舍尔	东风-122-17-4	针对NYCIII阴道菌生长培养基
PTFE涂层双刃剃须刀片	急救医疗服务	72000	用于SEM切割膀胱