从斑马鱼胚胎中分离和培养细菌以评估感染负荷

摘要

来源：Bernut, A., 等，利用斑马鱼胚胎解析和成像Mycobacterium abscessus的致病机制与菌索形成。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了一种从感染的斑马鱼胚胎中分离和定量脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）的实验方案。该流程包括胚胎安乐死、组织裂解和匀浆以释放细菌，随后进行离心并用表面活性剂缓冲液重悬。最后，将细菌悬液进行系列稀释，接种于添加抗生素的琼脂平板上，经培养后形成菌落并进行定量分析。

方案

1. 制备与保存M. abscessus 接种物
   1. M. abscessus 培养条件
      1. 从 -80°C 甘油保存液中取M. abscessus，接种于含10% OADC和0.5%甘油的Middlebrook 7H10琼脂平板（7H10ᴼᴬᴰᶜ）上，并根据编码荧光蛋白的载体所携带的抗性标记添加相应的抗生素。在30 °C下培养4–5天。
      2. 挑取一个荧光阳性分枝杆菌菌落，接种至含有OADC、0.2%甘油和0.05%吐温80（7H9ᴼᴬᴰᶜ/ᵀ）的1 ml Middlebrook 7H9液体培养基中，并加入所需抗生素，置于15 ml无菌塑料管中。在30 °C下静置培养1周。 
         注意：吐温80可抑制菌体聚集和成团。
      3. 将步骤2.1.2获得的预培养物重悬于50 ml Middlebrook 7H9ᴼᴬᴰᶜ/ᵀ培养基中，装入150 cm²组织培养瓶，调节至终浓度OD₆₀₀为0.1（约相当于5×10⁷个细菌/ml），继续在30 °C下培养4天，以获得处于对数生长期的菌液（OD₆₀₀ = 0.6–0.8）。 
         注意：为尽量减少菌体聚集（尤其是粗糙型菌株），培养时间不应超过5天。光滑型与粗糙型菌株的生长速率相似。
2. 制备M. abscessus接种物 
   注意：由于粗糙型M. abscessus极易形成大团聚集并产生索状结构，因此在向胚胎显微注射前，必须进行特定处理以获得均一且定量可控的接种物。该处理同样适用于虽有聚集但程度较轻的光滑型菌株。
   1. 将150 cm²组织培养瓶中对数生长期的菌液在室温下以4,000 × g离心15分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于1 ml 7H9ᴼᴬᴰᶜ/ᵀ培养基中。取200 µl菌悬液分装至1.5 ml微量离心管中。 
      注意：使用小体积样品并在1 ml注射器中操作，有助于获得高度均一的菌悬液。
   2. 用26号针头反复抽吸15次以均质化菌悬液，随后在水浴超声仪中进行三次超声处理，每次10秒，中间间隔10秒。加入1 ml 7H9ᴼᴬᴰᶜ/ᵀ后短暂涡旋振荡，然后以100 × g离心3分钟。
   3. 小心吸取上清液（含分枝杆菌），避免吸入沉淀中的团块，将各管上清液合并至一个50 ml无菌塑料管中，获得均一菌悬液。
   4. 肉眼观察是否存在残留的细菌聚集体。 
      注意：若仍可见聚集体，可再进行一次100 × g离心2分钟，随后收集上清液。
   5. 将菌悬液以4,000 × g离心5分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于200 µl 7H9ᴼᴬᴰᶜ/ᵀ中，立即用于注射。
   6. 通过将菌液在1×PBST中进行系列稀释后涂布于7H10ᴼᴬᴰᶜ琼脂平板，30 °C培养4天后计数菌落形成单位（CFU），以测定最终细菌浓度。每一批新制备的菌液均应进行CFU测定。
   7. 将5 µl菌悬液分装后于-80 °C保存，制备冷冻接种物储备液。 
      注意：使用-80°C冻存的分装样品前，必须测定其CFU，因为冻融过程可能影响接种物的细菌活力。这些冷冻接种物可直接用于后续注射实验。由于所有分装样品含有相同数量的CFU，因此可在不同实验间实现可重复的细菌注射。
3. 接种物质量控制 
   注意：可采用齐-尼氏染色法（特异性针对分枝杆菌）对均质化处理前后菌悬液的质量进行比较。
   1. 取一滴均质化后的菌悬液点样并涂布于载玻片上，待其完全干燥。将涂片置于65–70 °C的加热板上固定至少30分钟，然后按照齐-尼氏染色方案进行染色。
   2. 使用100倍物镜在显微镜下观察细菌涂片，并与未经处理的菌悬液涂片进行比较（图1）。

2. 准备斑马鱼胚胎

1. 斑马鱼卵的产卵与收集
   1. 在产卵前一天，将成年斑马鱼放入繁殖室中进行交配，每组放入2条雄鱼和1条雌鱼（通常2:1的比例可获得最佳受精率）。繁殖室为独立的鱼缸，内含卵收集篮。 
      注意：卵收集篮用于防止亲鱼吞食卵，并便于卵的收集。
   2. 在受精后1小时（hpf），收集卵，并将发育正常的胚胎转移至盛有25 ml蓝色养鱼水的100 mm培养皿中（每皿最多放置100个胚胎），并在28.5 °C条件下培养。未受精的卵应丢弃。
2. 斑马鱼胚胎注射前的准备
   1. 在受精后约24小时（hpf），使用精细镊子在100 mm培养皿中去除胚胎的绒毛膜，并在28.5 °C条件下继续培养。
   2. 使用移液器收集30–48 hpf的胚胎，并转移至盛有25 ml含270 mg/L三卡因（tricaine）养鱼水的“V”形定位槽中。使用自制的微加载尖端工具（经修剪的自制微加载尖端）将胚胎正确地摆放于通道内，以优化后续显微操作的便利性。 
      注意：进行尾静脉静脉内注射时，应使胚胎背侧朝下；进行尾部肌肉注射时，则应使背侧朝上。

3. 显微注射步骤

注意：为评估脓肿分枝杆菌（M. abscessus）感染的时间进程（包括存活率、细菌载量、感染动力学及感染特征），建议在30小时受精龄（hpf）胚胎的尾静脉内注射。为观察免疫细胞的募集情况，需在局部位点注射，例如在48小时受精龄（hpf）胚胎的尾部肌肉中注射。

1. 用含10%酚红的1×PBST稀释分枝杆菌接种物（根据拟给予的CFU数量确定稀释比例），以确认注射操作正确。
2. 使用微载样尖端将5-10 µl细菌接种液吸入显微毛细注射针中，将显微注射针连接至与注射仪相连的三维显微操作器的针夹上，并用精细镊子折断针尖顶端，使开口直径达到5-10 µm。
3. 通过调整显微注射压力（20–50 hPa）和时间（0.2 秒）来校准注射体积。
   注意： 通过肉眼观察注入胚胎卵黄中的液滴直径来校准所需注射体积。
4. 进行尾静脉注射时，将胚胎腹侧朝向针头，针尖靠近泄殖腔开口，对准尾静脉，轻柔推进针尖直至刺入尾静脉区域。注入所需体积的细菌悬液，通常为1-3 nl，每nl约含100 CFU。
5. 进行肌肉注射时，将胚胎背侧朝向针头，针头置于一个体节上方，注入少量（1 nl）接种物。
   注意： 至于尾静脉注射，肌肉注射同样难以操作。必须注意避免过量注射，以免损伤周围组织。
6. 注射操作结束后，通过将相同体积的细菌悬液注入一滴无菌PBST中，随后涂布于7H10ᴼᴬᴰᶜ培养基上，以控制接种物的量。 并计数CFU。大约可使用针头注射100个胚胎。 
   注意： 因为表面粗糙 M. abscessus 接种物制备后需立即进行注射，以免在针头中继续形成聚集体。
7. 将感染的鱼单独转移至含有2 ml/孔鱼水的24孔板中，于28.5 °C下孵育。注射1-3 nl 1X PBS的胚胎可作为对照。
8. 使用荧光显微镜监测胚胎中荧光细菌的正常感染情况。

4. 细菌负荷定量

1. 通过菌落形成单位（CFU）计数进行测定
   1. 在预定时间点，将感染的胚胎分组收集（每组5个胚胎）至1.5 ml微量离心管中（每管1个胚胎），将胚胎置于冰上孵育10分钟进行冷冻麻醉，随后使用过量三卡因（300–500 mg/L）实施安乐死。
   2. 用无菌水清洗胚胎两次，并转移至新的离心管中。使用26号针头在1×PBST中加入2% Triton X-100裂解每个胚胎，并将悬液充分匀浆直至完全裂解。离心后，将沉淀重悬于含0.05% Tween 80的1×PBST中。将匀浆液进行系列稀释后，接种于Middlebrook 7H10ᴼᴬᴰᶜ琼脂平板，并根据供应商建议添加BBL MGIT PANTA补充剂。 
      注意：M. abscessus 对NaOH处理的敏感性高于M. marinum。使用BBL MGIT PANTA抗生素混合物可有效实现鱼类裂解物的去污染，同时不影响M. abscessus的生长。
   3. 在30 °C下培养平板4天，随后计数菌落。

结果

图1. 分散的M. abscessus接种物的制备。在任何处理之前（上图）或处理之后（下图）于液体培养基中培养的R型或S型菌株的齐-尼染色，以减少分枝杆菌聚集体的大小和数量（依次进行吹打、超声和倾注处理）。使用配备100X APO油镜（1.4 NA）物镜的显微镜观察细菌。比例尺：20 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
牛血清白蛋白	Euromedex	04-100-811-E
牛肝过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 琼脂	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 肉汤	BD Biosciences	271310
甲磺酸乙酯三卡因（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040
油酸	Sigma-Aldrich	O1008
多聚甲醛	Delta Microscopie	15710
酚红	Sigma-Aldrich	319244
吐温-80	Sigma-Aldrich	P4780
琼脂	Gibco Life Technologie	30391-023
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich
Instant Ocean 海盐	Aquarium Systems Inc
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 mm 外径 × 0.78 mm 内径
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown 微量移液器拉制仪 p-87
显微注射仪	Tritech Research		数字显微注射仪 MINJ-D
镊子	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
微量移液器加样头	Eppendorf