建模 气单胞菌属 发病机制 C. elegans 使用存活率测定实验

摘要

来源： Chen, Y., 等评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在A中 秀丽隐杆线虫 模型。 视频实验杂志 (2018)

本视频展示了一种利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）模拟气单胞菌（Aeromonas）致病过程的存活率检测方法，通过线虫摄食细菌引发肠道感染并导致死亡，从而在活体宿主系统中对细菌毒力进行定量评估。

方案

1. C. elegans 存活率检测 气单胞菌属

1. 在将L1幼虫接种到含有ENGM（富集线虫生长培养基）的培养皿的当天 E. coli OP50，挑取四种菌株各自的单个菌落 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50，并分别在37 °C下用2 mL LB肉汤培养16小时。
   注意： 为避免污染，此步骤应在超净工作台中进行。本实验使用了以下菌株： 大肠杆菌 OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完成全序列测定的致病性临床菌株 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学医院的代表性临床分离株。
2. 测量OD₆₀₀ （600 nm 处的光密度）细菌培养液的吸光度，并将细菌培养液调整至 OD₆₀₀ = 2.0，使用LB肉汤。
3. 在每块6 cm NGM（线虫生长培养基）平板上分别点样并涂布30 µL细菌培养液。将平板于室温下培养过夜。
   注意： 制备NGM培养基：将3 g NaCl（氯化钠）、2.5 g细菌蛋白胨和20 g琼脂溶解于1 L去离子水中。121 °C高压灭菌20分钟。待培养基在水浴中冷却至55 °C后，加入1 mL 1 M CaCl₂。₂ （氯化钙），1 mL 1 M MgSO₄₄ （硫酸镁）、1 mL 5% 乙醇胆固醇溶液和 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。
4. 在L1幼虫发育至L4阶段的当天，随机挑选并转移50条线虫至含有以下四种之一的NGM平板 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50
5. 在20 °C下孵育NGM平板，直至实验结束。
6. 将所有存活的线虫转移至新制备的含细菌NGM平板上，每天统计活虫、死虫和传感器线虫的数量，直至最后一条线虫死亡。
   注意： 每天将线虫转移至新制备的NGM平板，以维持感染状态，即使使用无菌线虫（例如glp-4，或使用氟脱氧尿苷（FudR）。
7. 根据每日数据计算结果绘制生存曲线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摇床培养箱	YIH DER	LM-570R	细菌培养
NaCl	SIGMA	31434	培养基制备
MgSO₄	SIGMA	M7506	培养基制备
琼脂	Difco	214530	培养基制备
CaCl₂	SIGMA	C1016	培养基制备
胆固醇	SIGMA	C8503	培养基制备
6 cm 培养皿	ALPHA PLUS	46	琼脂平板制备
细菌蛋白胨	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培养基制备
FudR	SIGMA	1271008	培养基制备
显微镜系统	Nikon	Eclipase Ti inverted	显微成像