使用C. elegans液体毒性检测法评估细菌毒力

摘要

来源：Chen, Y., et al. 利用秀丽隐杆线虫模型评估气单胞菌感染的毒力与致病机制。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了利用嗜水气单胞菌（Aeromonas）对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行的液体毒性测定实验，该方法通过测量线虫在营养受限的液体环境中的存活情况来评估细菌的毒力。该实验可根据毒素对C. elegans造成的损伤程度和死亡率，揭示不同菌株的特异性致病性。

方案

1. 秀丽隐杆线虫 液体毒性检测实验 气单胞菌属

注意： 为避免污染，所有步骤应在层流罩内进行。

1. 接种L1幼虫至涂有ENGM（富集型线虫培养基）平板的次日 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株和 E. coli OP50，并在37℃下各用5 mL LB肉汤培养 °16 小时，4 ℃
   注意： 在本实验方案中，使用了以下细菌菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完全测序的致病性临床 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学附属医院的代表性临床分离株。 
   注意： 为制备富集型NGM（ENGM），将3 g NaCl、5 g细菌蛋白胨、1 g酵母提取物和30 g琼脂溶解于1 L去离子水中。121℃高压灭菌 °C 反应 20 分钟。待冷却至 55 °C 的水浴中，加入 1 mL 1 M CaCl₂，1 mL 1 M MgSO₄₄，1 mL 5% 胆固醇乙醇溶液，以及 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。
2. 测量OD₆₀₀ 细菌肉汤的吸光度
3. 将细菌培养液在 3,500 x g 孵育15分钟以去除LB肉汤。重悬细菌，并将菌液调整至OD₆₀₀ = 3.0，加入 S 培养基。加入 195 µ在96孔板中至少8个孔内，每孔加入S培养基中的细菌培养液。
   注意： S 培养基的成分：配制 S 培养基时，混合 40 mL S 基础液、0.4 mL 1 M 柠檬酸钾、0.4 mL 微量金属溶液、0.12 mL 1 M CaCl₂。₂，0.12 mL 1 M MgSO₄₄, 40 µ5% 胆固醇乙醇溶液和 1 mL 8 mM FudR，使用前加入。
4. 用ENGM平板冲洗L4期蠕虫 E. coli 使用M9培养基的OP5。将线虫溶液调整至每5条线虫为一个单位 µL 并加入 5 µ将 100 μL 蠕虫溶液加入 96 孔板的每个孔中，确保每孔约有 25 条蠕虫。
5. 将96孔板置于摇床中，在25℃、200 rpm条件下孵育 °C.
6. 在24、48和72小时后分别计数活线虫和死线虫的数量。根据以下公式计算每个孔的存活率：（活线虫数 / 总线虫数） × 100%.
7. 使用每日数据计算结果绘制散点图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摇床培养箱	YIH DER	LM-570R	细菌培养
NaCl	SIGMA	31434	培养基制备
MgSO₄	SIGMA	M7506	培养基制备
琼脂	Difco	214530	培养基制备
CaCl₂	SIGMA	C1016	培养基制备
胆固醇	SIGMA	C8503	培养基制备
乙醇	SIGMA	32205	培养基制备
KOH	SIGMA	P5958	培养基制备
6 cm 培养皿	ALPHA PLUS	46	琼脂平板制备
96孔板	FALCON	353072	液体检测
细菌蛋白胨	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培养基制备
酵母提取物	SIGMA	92144	培养基制备
柠檬酸•H₂O	SIGMA	C1909	培养基制备
三水合柠檬酸钾•H₂O	SIGMA	104956	培养基制备
FudR	SIGMA	1271008	培养基制备
EDTA二钠	SIGMA	E1644	培养基制备
胰蛋白胨	SIGMA	16922	培养基制备
显微镜系统	尼康	Eclipase Ti 倒置显微镜	显微镜成像
科学级CCD相机	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	显微镜成像