利用 秀丽隐杆线虫 液体毒性分析评估细菌毒力

摘要

来源： 陈Y等 人。 在秀丽隐杆线虫模型中评估气单胞菌感染的毒力和发病机制。 J. Vis. Exp. （2018年）。

本视频演示了使用气单胞菌进行的秀 丽隐杆线虫 液体毒性测定，这是一种通过测量线虫在营养有限液体环境中存活率来评估细菌毒力的方法。该检测显示了基于秀 丽隐杆线虫毒素损伤和死亡率的程度，具有菌株特异性的致病性。

方案

1. 秀丽隐杆线虫液体毒性测定法含气单胞菌

注意： 为避免污染，应在层流罩内进行步骤。

1. 在用大 肠杆 菌OP50铺布的富集线虫培养基（ENGM）上播种L1线虫的次日，取取四个 气单 胞菌株和大 肠杆 菌OP50各一个菌落，用5毫升LB肉汤在37°C下培养16小时。
   注意： 该方案中使用了以下菌株： 大肠杆 菌OP50，秀 丽隐杆线虫的正常食物来源。A. dhakensis AAK1，首个完全测序的临床病原 性A. dhakensis 分离株。水 蜜蜂 A2-066、 A. veronii A2-007和 A. caviae A2-9307121是国立成功大学医院的代表性临床分离株。 
   注意： 为制备富集NGM（ENGM），将3克NaCl、5克细菌肽、1克酵母提取物和30克琼脂溶解于1升去离子水中。在121°C下高压灭菌20分钟。等到在水浴中冷却至55°C后，加入1毫升1 M CaCl₂、1毫升1 M MgSO₄、1毫升乙醇中5%胆固醇和25毫升磷酸缓冲液。搅拌均匀。
2. 测量细菌汤的吸收度OD₆₀₀ 。
3. 将细菌汤液以3500 克离 心15分钟，去除LB汤。将细菌重新悬浮，并用S培养基将细菌肉汁调至OD₆₀₀ = 3.0。在96孔培养基中至少8孔中加入195微升细菌汤液。
   注意： S培养基的成分：制备S培养基时，使用前混合40毫升S基碱、0.4毫升1M柠檬酸钾、0.4毫升微量金属溶液、0.12毫升1M钙_2、0.12毫升1M硫酸氢氧化氢、40微升5%乙醇中胆固醇和1毫升8毫米FudR。
4. 用大 肠杆 菌OP5用M9培养基冲洗ENGM板上的L4虫。将蚯蚓溶液调整至每μL5个蚯蚓，并在96孔板的每个孔中加入5微升蚯蚓溶液。确保每口井大约有25个蚯蚓。
5. 将96孔板在摇床上以200转/分钟、25摄氏度孵育。
6. 统计24小时、48小时和72小时后活虫和死虫的数量。用以下公式计算每口井的存活率：（活虫数/总数）100%×。
7. 用每日数据计算绘制散点图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摇床孵化器	YIH DER	LM-570R	细菌孵育
氯化钠	SIGMA	31434	培养基制备
米格索尔	SIGMA	M7506	培养基制备
琼脂	迪夫科	214530	培养基制备
CaCl₂	SIGMA	C1016	培养基制备
胆固醇	SIGMA	C8503	培养基制备
乙醇	SIGMA	32205	培养基制备
KOH	SIGMA	P5958	培养基制备
6厘米肝板	阿尔法加	46	琼脂平板制备
96孔板	猎鹰	353072	液体测定
细菌肽	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培养基制备
酵母提取物	SIGMA	92144	培养基制备
柠檬酸•H₂O	SIGMA	约1909年	培养基制备
柠檬酸三钾•H₂O	SIGMA	104956	培养基制备
FudR（诅咒）	SIGMA	1271008	培养基制备
二钠EDTA	SIGMA	E1644	培养基制备
特氨酸	SIGMA	16922	培养基制备
显微镜系统	尼康	Eclipase Ti 倒置	显微成像
科学CCD相机	问：思维	Retiga-2000R Fast 1394	显微成像