肌肉坏死检测 秀丽隐杆线虫 由致病性诱导 气单胞菌属 菌株

摘要

来源： Chen, Y. 等。 评估气单胞菌感染在一种动物模型中的毒力与致病机制 秀丽隐杆线虫 模型。 视频实验杂志 (2018)

本视频展示了利用致病性气单胞菌（Aeromonas）菌株在秀丽隐杆线虫（C. elegans，Caenorhabditis elegans）中进行的肌肉坏死检测方法。通过将表达绿色荧光蛋白（GFP）的线虫喂养于接种了Aeromonas的培养板上，该检测可模拟细菌感染过程，并通过荧光成像揭示组织损伤情况。肌肉结构的进行性丧失以及GFP信号的减弱表明了由Aeromonas诱导产生的坏死反应。

方案

1. 秀丽隐杆线虫 肌肉坏死检测实验 气单胞菌属

注意： 为避免污染，这些步骤应在层流罩中进行。

1. 在将L1幼虫接种到涂有富集型线虫生长培养基（ENGM）的当天 大肠杆菌 OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株和 E. coli OP50 和培养物分别在 37 °C 下于 2 mL 胰蛋白胨-酵母提取物（Luria-Bertani，LB）液体培养基中培养 16 小时。​注意： 此处使用的细菌菌株如下： E. coli OP50，一种正常的食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完成全序列测定的致病性临床 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学医院的代表性临床分离株。
2. 测量 OD₆₀₀ 细菌肉汤的吸光度，并将细菌肉汤调整至OD₆₀₀ = 2.0 的 LB 肉汤。取 30 µL 菌液点样并涂布于 6 cm 线虫生长培养基（NGM）平板上。室温培养过夜。
3. 在L1幼虫发育至L4阶段的当天，将50条线虫分别转移到含有四种不同条件的NGM平板上 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50。将NGM平板在20 °C培养。每隔24小时将线虫转移至新制备的含细菌NGM平板。
4. 使用荧光显微镜拍摄肌肉图像。
   1. 在载玻片上的M9培养基2%琼脂糖凝胶中随机选取10条线虫。在成像前，加入2 µL含1%叠氮化钠的M9培养基溶液处理线虫，于琼脂糖上麻痹少于5分钟。
   2. 放置盖玻片，使用配备电荷耦合器件相机的荧光显微镜，通过绿色荧光蛋白（GFP）滤光片采集肌肉图像。在L4阶段后的24、48和72小时分别采集肌肉图像。

使用图像处理软件进行图像分析和图示制备。
注意： 评分标准及肌肉损伤程度的定义见图1，其判断标准如下：缺失肌纤维计3分；断裂或破裂的肌纤维计2分；弯曲的肌纤维计1分；正常健康的肌纤维计0分。

结果

图1：肌肉坏死的相应评分 秀丽隐杆线虫 诱导的 气单胞菌属 感染 肌肉坏死的评判标准及对应评分如下：缺失的肌纤维计3分；破裂或断裂的肌纤维计2分；弯曲的肌纤维计1分；健康的肌纤维计0分。图中所示为弯曲的肌纤维（箭头）、破裂的肌纤维（空心箭头）和缺失的肌纤维（星号）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摇床培养箱	YIH DER	LM-570R	细菌培养
K₂HPO₄	J.T.Baker	MP021519455	培养基制备
KH₂PO₄	J.T.Baker	3246-05	培养基制备
Na₂HPO₄	J.T.Baker	MP021914405	培养基制备
NaCl	SIGMA	31434	培养基制备
MgSO₄	SIGMA	M7506	培养基制备
琼脂	Difco	214530	培养基制备
CaCl₂	SIGMA	C1016	培养基制备
胆固醇	SIGMA	C8503	培养基制备
乙醇	SIGMA	32205	培养基制备
KOH	SIGMA	P5958	培养基制备
6 cm 培养皿	ALPHA PLUS	46	琼脂平板制备
细菌蛋白胨	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培养基制备
酵母提取物	SIGMA	92144	培养基制备
柠檬酸•H₂O	SIGMA	C1909	培养基制备
三水合柠檬酸三钾•H₂O	SIGMA	104956	培养基制备
FudR	SIGMA	1271008	培养基制备
乙二胺四乙酸二钠	SIGMA	E1644	培养基制备
七水合硫酸亚铁·7H₂O	SIGMA	215422	培养基制备
四水合氯化锰·4H₂O	SIGMA	221279	培养基制备
七水合硫酸锌·7H₂O	SIGMA	204986	培养基制备
五水合硫酸铜·5H₂O	SIGMA	C8027	培养基制备
胰蛋白胨	SIGMA	16922	培养基制备
显微镜系统	Nikon	Eclipase Ti inverted	显微成像
科研级 CCD 相机	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	显微成像