由菌毛纤维介导的细菌水凝胶图案的稳定化

摘要

来源： Spiesz, E. M., 等，利用自制生物打印机对工程化生物膜进行三维图案化。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种用于比较含有对照菌株或基因工程菌株的3D打印海藻酸盐图案的方法。实验菌株在诱导后可产生卷曲纤维（curli fibers），从而增强海藻酸盐水凝胶的结构稳定性。经钙离子螯合溶液处理后，仅实验组图案保持完整，凸显了卷曲纤维产生对结构的稳定作用。

方案

1. 3D 打印过程

1. 在计算机上安装并打开3D打印软件（材料表）。将3D打印机连接到计算机。通过点击X、Y和Z轴的归零按钮，将打印头移至其初始位置。
2. 每次打印时，将准备好的打印基底放置在打印平台上的特定位置。
3. 校准打印头在Z轴方向的高度。
   1. 在手动控制下将打印头抬升至22 mm高度，以确保其在移动至目标位置时不会与培养皿边缘发生碰撞。将打印头移至培养皿上方，然后向下移动，直至移液针头接触打印表面。将此Z轴位置设定为Z1（即打印表面的高度）。
   2. 抬起打印头，并通过X、Y和Z轴的手动控制将其移出培养皿区域。若将打印头与培养皿表面之间的工作距离定义为Z2，则在打印程序中输入Z1 + Z2作为打印过程中的Z值。
4. 根据所需的打印轨迹，采用自主开发的逐点坐标确定法对打印图形进行编程。
   1. 若所需轨迹为直线，仅需定义起点和终点。在曲线路径上增加更多点可获得更平滑的曲线。手动依次将打印头移动至各点，并按顺序记录这些点的坐标。将所有坐标以及每段打印路径的打印头移动速度输入G代码编辑器中。
5. 在打印前后，均应将打印头抬升至高于培养皿边缘的距离（20 mm），并直接移出培养皿区域。将该程序保存为G代码文件，供后续打印直接调用，但每次更换新的打印基底时需重新测量Z轴高度。
   注意：参见表1中打印正方形的G代码示例。
6. 加载预编程的G代码文件。在软件中打开G代码编辑器，并输入用于打印目标图形的指令。在每一行指令中，可更改打印头在X、Y和/或Z轴的位置。在所有打印步骤中输入的Z值应为Z1 + Z2（打印表面高度 + 工作距离）。
   注意：移动速度也可调节；9,000 mm/min 是典型打印速率下的合适值。
7. 将液态生物墨水装入注射器，并将其安装至3D生物打印机的注射泵中。
8. 点击“打印”按钮，将生物墨水打印至打印基底上。
9. 打印过程中，完全通过软件控制打印头的移动。在打印头接触打印表面之前，手动启动注射泵。
   注意：注射泵与打印机的协同操作需根据挤出速度、打印头移动至首个打印点的速度以及打印头的初始位置经验性确定。若初始打印头位置为20 mm，打印头速度为9,000 mm/min，挤出速度为0.1 mL/h，则在开始打印后立即启动注射泵。若挤出速度由0.1 mL/h调整为0.3 mL/h，则应在开始打印后等待2−3秒再启动注射泵。
10. 当打印头到达最后一个打印点时，立即停止注射泵。在打印结束前、打印头抬升之前停止注射泵，否则多余的生物墨水会滴落至打印基底上，降低打印分辨率。
11. 为构建三维结构，需在G代码编辑器中控制打印头的所有移动。输入第一层的打印高度。在G代码中将第二层的Z值增加0.2毫米以提高打印高度。此后，每向上增加一层，Z值增加0.1毫米。打印过程中不得移动打印平台。
12. 为测量所打印水凝胶的宽度和高度，可将钢尺置于样品下方或旁边进行测量。

2. 生物膜产生能力的培养与有效性检测 E. coli

1. 将打印的样品在室温下孵育3−6天，以促进生物膜组分（纤维素纤维）的生成。使用相机或荧光扫描仪对平板进行成像。
2. 为溶解海藻酸盐基质，向打印基底中加入20 mL 0.5 M柠檬酸钠溶液（用NaOH调节pH至7），在室温下以30 rpm振荡孵育2 h。弃去液体后再次对平板成像，并与柠檬酸处理前的图像进行比较。

表1：打印正方形的G代码编程过程及说明。

G代码指令	任务
G1 Z20 F9000	以9,000 mm/min的移动速度将Z轴抬升至20 mm高度。
G1 X95 Y65 F9000	以9,000 mm/min的移动速度移动至第一条线的起始点。
G1 Z6 F9000	沿Z轴方向向下移动至合适的打印距离（此处为Z = 6 mm）。
G1 X95 Y105 F300	第一条线的终点，同时也是第二条线的起始点。
G1 X135 Y105	第二条线的终点，同时也是第三条线的起始点。
G1 X135 Y65	第三条线的终点，同时也是第四条线的起始点。
G1 X95 Y65	第四条线的终点，同时也是第一条线的起始点；形成一个正方形。
G1 Z20 F9000	以9,000 mm/min的速度将Z轴抬升至20 mm高度。
G1 X55 Y40 F9000	移动至培养皿范围外的坐标点（55, 40）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB肉汤粉末	Sigma-Aldrich	L3022
摇床	VWR	89032-092	Model 3500
培养皿	VWR	25384-326	150 x 15 mm
鼠李糖	Sigma-Aldrich	83650
硅胶管	VWR	DENE 3100103/25
注射泵	ProSense B.V.	NE-300
海藻酸钠	Sigma-Aldrich	W201502
柠檬酸一钠	Sigma-Aldrich	71498
氢氧化钠	VWR	28244.295