荧光标记细菌中染色体分离的延时成像

摘要

来源： Schumacher, D.，和 Sogaard-Andersen, L. 缓慢生长的社会性细菌完整营养细胞周期的荧光活细胞成像 黏球菌属黄单胞菌。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用活细胞成像技术追踪荧光标记的细菌染色体复制起始位点在细胞分裂过程中的动态行为。通过时间序列的相差显微镜与荧光显微镜成像，记录染色体分离的动力学过程。

方案

1. 显微镜设置与延时成像采集

注意：此处所述方案是为配备自动对焦功能的倒置宽场显微镜、100X/1.30 NA 油镜 PH3 物镜、X、Y 轴电动载物台、sCMOS 相机、激发绿荧光、红荧光或黄荧光蛋白的滤光片系统，以及温度控制培养室的系统所开发的。该培养室可使细胞免受光照，并维持恒定温度。

1. 在开始显微成像前约1 - 2小时，将培养室和显微镜预热至32 °C。
   注意：根据显微镜配置的不同，加热可能需要更长时间。预热对于减少漂移并稳定自动对焦控制系统至关重要。
2. 打开显微镜并启动显微镜控制软件。选择正确的物镜以及用于获取相差图像、绿色荧光、红色荧光或黄色荧光蛋白图像的相应反射镜和滤光片。
   注意：显微镜通常配备推荐的控制与图像采集软件。本实验中使用了一款市售软件（见材料表）来控制显微镜和图像采集。
3. 在物镜和已预孵育至32 °C的样品底部各加一滴高质量浸油。将物镜置于尽可能低的Z位置，以避免放置样品时损坏物镜。将带有样品的金属框架放置在显微镜载物台上，使“有孔面”朝向物镜。牢固地将样品固定在载物台夹持器中。
4. 通过将载物台沿Z方向向物镜靠近来对细胞进行对焦。当样品底部的油滴与物镜接触时，应缓慢移动载物台。在X/Y方向移动载物台，直到视野区域内可见多个单个细胞（当细胞处于焦平面时）。确保视野区域内至少包含一个荧光微球，以便后续对所采集图像进行对齐。
   注意：在理想条件下，每个视野区域（2,048 × 2,048像素或133.1 × 133.1 µm）应达到15 - 30个细胞的密度。
5. 打开显微镜控制软件中的多维采集向导，设置一个时间序列实验，使显微镜能够根据需要在多个波长和多个载物台位置采集图像。
   1. 在主选项卡中，启用时间序列和多波长选项。窗口左侧将出现额外的选项卡。
   2. 点击保存选项卡，点击选择目录，选择计算机硬盘上的一个空文件夹以保存采集的图像。启用若文件存在则递增基础名称，以确保连续的数据集不会覆盖先前的数据。然后为实验命名，包括日期以及菌株名称或实验标题。
   3. 点击时间序列选项卡以调整时间序列参数。将持续时间设为24小时，将时间间隔设为20分钟。时间点数量将自动更新。
      注意：最佳时间间隔取决于具体实验和待分析的细胞功能。频繁成像可能导致光漂白，因此必须通过实验权衡时间分辨率与光漂白效应。在倍增时间为4 - 6小时的情况下，相差显微镜成像可轻松以5分钟（或更短间隔）进行。若需进行24小时时间序列的荧光显微成像，则建议以约15 - 30分钟的间隔采集图像。
   4. 点击波长选项卡。通过更改数量来设定每个时间点每幅图像需采集的波长数。
      注意：每增加一个波长，多维采集向导左侧将出现一个新的选项卡，波长将按从上到下的顺序依次采集。每个波长的采集参数可单独调整。
   5. 点击最上方的第一个波长选项卡。在照明下拉菜单中选择相差模式。将曝光时间设为100 ms，并在采集下拉菜单中选择每个时间点。通过在下拉菜单中选择从不来关闭自动曝光功能。
   6. 对每个需要在每个时间点采集的波长重复步骤3.5.5。针对本实验设置及此处描述的荧光标记蛋白，使用以下曝光时间参数：mCherry融合蛋白为250 ms，YFP（黄色荧光蛋白）融合蛋白为200 ms，GFP（绿色荧光蛋白）融合蛋白为1,000 ms。​
      注意：每种菌株和荧光蛋白的最佳照明参数应通过预先调整光源强度和各波长的图像采集时间来确定。过长的图像采集时间会增加光毒性效应，最终导致生长停滞和细胞死亡。因此，应在图像质量与细胞活力之间取得平衡。
   7. 采集多个载物台位置的图像，以增加同一次实验中记录的细胞数量。
      1. 若需在多个载物台位置采集图像，请在主选项卡中启用多个载物台位置。然后点击载物台选项卡，并点击实时按钮以查看视野。
      2. 在X/Y方向移动载物台，使感兴趣区域（ROI）进入视野。通过点击载物台选项卡中的“+”按钮保存当前X和Y坐标。再次在X/Y方向移动载物台，找到新的感兴趣区域，并再次点击“+”保存坐标。重复此过程，直至保存所需数量的区域。
         注意：若进行荧光图像采集，应确保各感兴趣区域之间保持足够距离，以尽量减少光毒性。
6. 再次检查细胞是否处于焦点：点击各个已保存的X和Y位置，并点击AFC保持启动硬件自动对焦功能，以在整个实验过程中保持已保存的Z位置恒定。
7. 在多维采集向导中点击采集按钮，开始显微镜的时间序列记录。
   注意：每个采集的波长将弹出一个独立窗口，另有一个窗口显示已采集的时间点数量及下一次图像采集的剩余时间。
8. 在时间序列记录的最初几个时间点后，检查细胞是否仍处于焦点，必要时重新对焦，以最大化图像质量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMI6000B 配 AFC	Leica microsystems	11888945	配备自适应聚焦控制的全自动倒置宽场荧光显微镜
通用载物架	Leica microsystems	11532338	适用于不同样品尺寸的载物台支架
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 油 PH3	Leica microsystems	11506197	相差物镜
Orca Flash 4.0 相机	Hamamatsu	11532952	400 万像素 sCMOS 成像相机
滤光片组 TXR ET, k	Leica microsystems	11504170	荧光滤光片组，激发：560/40，发射：645/75
滤光片组 L5 ET, k	Leica microsystems	11504166	荧光滤光片组，激发：480/40，发射：527/30
滤光片组 YFP ET, k	Leica microsystems	11504165	荧光滤光片组，激发：500/20，发射：535/30
ProScan III	Prior	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	配备交互式控制中心的显微镜自动化控制器
EL 6000 光源	Leica microsystems	11504115	外置荧光光源
Incubator BLX Black	Pecon	11532830	环绕显微镜的黑色培养室
Tempcontrol 37-2 digital	Leica microsystems	11521719	培养室自动温控系统
Filtropur BT25 0.2 瓶顶滤器	Sarstedt	831,822,101	用于缓冲液灭菌的瓶顶滤器
Deckgläser	VWR	630-1592	玻璃盖玻片（60 × 22 mm，厚度：0.7 mm）
Seakem LE 琼脂糖	Lonza	50004	用于显微镜载玻片的琼脂糖
Leica Metamorph AF	Leica microsystems	11640901	显微镜控制软件及图像分析软件
Tetraspeck 微球，0.5 µm	ThermoFisher	T7281	荧光微球