活细胞延时成像观察Bdellovibrio bacteriovorus对E. coli的捕食过程

摘要

来源：Makowski, Ł., et al．利用延时荧光显微镜对细菌捕食者Bdellovibrio bacteriovorus生命周期进行活细胞成像．J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在琼脂糖垫下对固定化的E. coli被Bdellovibrio bacteriovorus捕食的过程进行延时荧光成像，可实时观察其胞内复制及子代释放，用于研究细菌捕食行为与宿主-病原体相互作用。

方案

1. 进行延时荧光显微镜观察

1. 将35 mm培养皿放入培养皿 holder 中，确保其在实验过程中不会移动。在物镜和35 mm培养皿底部各滴加一滴浸油（折射率为1.518）。
2. 将holder安装到倒置显微镜的载物台上，置于显微镜腔室内。
3. 在显微镜控制软件中设置参数，以在多个时间点对多个视野位置进行图像采集。
   1. 设置放大倍数（100倍）和多色荧光镜组（GFP（绿色荧光蛋白）/mCherry）。通过目镜和明场（BF）找到焦平面，并打开点位列表管理器。
   2. 移动载物台，选择至少10个感兴趣的视野位置，并通过点击Mark point按钮将每个位置的坐标保存至显微镜软件中。避免选择彼此过于接近的位置，以防止光漂白和光毒性。将相机通路从目镜切换至显示器，并在点位列表管理器中通过设定焦平面并点击Replace point按钮对每个点位进行校准。
   3. 打开实验设计模块，在各个选项卡中设置如下实验参数：
      1. 取消勾选Z-stacking选项。
      2. 选择荧光通道并设置最佳照明参数。本实验中使用的参数如下：mCherry通道采用mCherry滤光片组（EX575/25；EM625/45），激发强度为50%，曝光时间为200 ms；GFP通道采用GFP滤光片组（EX475/28；EM525/48），激发强度为50%，曝光时间为80 ms；明场图像采用POL通道，强度为5%，曝光时间为50 ms。
      3. 设置图像采集的时间间隔和实验总时长。本实验中设置为每5分钟采集一次，持续10小时。
      4. 启用所选位置的焦点维持功能（本系统通过勾选Maintain focus with UltimateFocus复选框实现）。
      5. 选择用于自动保存图像文件的数据文件夹。
      6. 再次核对显微镜控制软件中的所有设置，然后启动延时成像实验。
4. 实验开始一小时后，检查所有视野位置是否仍处于焦点上。如有需要，在图像采集的间隔期间调整焦距。
5. 延时成像实验结束后，取出培养皿，并根据生物安全规程处理带有琼脂糖垫的35 mm培养皿。
   注意：第1.2步之后的所有子步骤均针对DeltaVision Elite用户。使用其他系统的研究人员需根据各自系统调整相应设置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
认证分子生物学琼脂糖	BIO-RAD	161-3100	用于琼脂糖垫的低荧光琼脂糖
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	开源图像处理软件包
35 mm 玻璃底培养皿	ibidi	81218-200	未包被玻璃
显微镜	GE	DeltaVision Elite	微孔板载物台、终极聚焦激光模块、DV Elite CoolSnap HQ2 相机、SSI 组装 FP DV、Oly 100x 油镜 1.4 NA 物镜套件、棱镜 Nomarski 100x 长工作距离微分干涉差（DIC）装置、ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Start SoftWoRx	GE		厂商提供的成像软件