通过荧光成像可视化细菌蛋白分布的三维

Abstract

来源： Bratton， B. P. 等， 《细菌细胞的三维成像以实现细胞准确表征和蛋白质定位》。 J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了获取和分析细菌细胞三维荧光图像的方法，以研究单细胞层面的蛋白质组织。

Protocol

1. 成像

1. 将密封载玻片插入显微镜，静置5分钟以使温度与周围环境平衡。显微镜室的温度可能与样品准备室不同。
2. 取样品的荧光Z叠。
   注意： Z堆栈应完全覆盖样品，z间距小于景深。对于1.45 NA 100x物镜和~1微米厚的大 肠杆菌 细胞，40步、每步100 nm效果良好。对于较大的细胞或无法完全平躺在表面的细胞，可能需要50个或更多的步骤。包含足够的步骤，并确保采样上下完全模糊。
   1. 使用显微镜相关的软件（见 材料表）来控制显微镜。
   2. 用显微镜对焦轮对焦细胞中间。在ND获取下，勾选Z框以获取Z叠。点击主页按钮，将单元格中间设置为起点。将步长设为0.1微米，距离设为4微米。确保Z器件设置为压电级。
   3. 将Lambda窗口下的荧光通道设置为成像荧光分子的设置。该实验中使用了GFP和mCherry。
      注意： 如果需要额外荧光通道的三维分布，可以在第二色通道中再加一个步长和范围相同的Z堆栈。在该实验中，使用细胞质mCherry来确定细胞形状，MreB-GFP作为第二色通道。
   4. 确保实验顺序设置为λ（z系列），以便在切换前对每个色道进行完整的Z叠加。
   5. 点击立即运行以开始图像采集，并在一个或两个z堆栈完成后保存文件。
   6. 移动到垫子的新区域，重复步骤1.2.2-1.2.5。

2. 细胞重建

1. 裁剪单个单元格，并保存为叠加的tiff文件，这样每个文件只有一个单元格。确保该单元格与其他单元格良好隔离（即约为xy中模糊函数全宽半最大值的5倍）。
   注意： 这可以通过免费的图像分析软件完成（见 材料表）。
   1. 在单个单元周围画一个方框，每个通道复制该单元2次。确保勾选了重复超堆栈框，并将通道改为1或2，确保切片包含整个z栈。
      注意： 如果只成像细胞的形状而非额外的荧光蛋白，则只会有一个通道存在。
   2. 当两个堆栈都可用后，请前往图片 |书堆 |工具 |将图像与蛋白质通道连接起来，再结合形状通道。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂糖	西格玛-奥尔德里奇	A9539
棉签	清教徒医疗产品公司有限责任公司	S304659	用于Appy VaLaP
封面滑动	VWR	16004-302
斐济	图片J	https://fiji.sc	用于克隆细胞
羊毛脂	西格玛-奥尔德里奇	L7387	与石蜡和凡士林结合，生成VaLaP。
LB培养基	BD Difco	DF0446173
M63中型	美国生物	M1015
MATLAB	数学作品		需要运行卷积脚本
显微镜载玻片	费舍尔	12-550-133
NIS元素	恩孔
石蜡	西格玛-奥尔德里奇	327212
凡士林	等价	49035-038-27
压电Z级	尼康	77011589
移液器头 -p200	美国科学	1111-0730
移液头 - 第10页	美国科学	1111-3730