通过荧光成像实现细菌蛋白质分布的三维可视化

摘要

来源：Bratton, B. P., et al., 用于精确细胞表征与精准蛋白质定位的细菌细胞三维成像。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了获取和分析细菌细胞三维荧光图像的方法，用于在单细胞水平上研究蛋白质的组织结构。

方案

1. 成像

1. 将密封的载玻片放入显微镜中，并静置5分钟，使其温度与周围环境达到平衡。显微镜室的温度可能与样品制备室不同。
2. 对样品采集荧光z轴层扫图像。
   注意： z轴层扫应完全覆盖样品，z轴步进间距应小于景深。对于1.45数值孔径（NA）的100倍物镜和约1 μm厚的E. coli细胞，每步0.1 μm、共40步的效果良好。对于较大的细胞或未能完全平贴于表面的细胞，可能需要50步或更多。应包含足够的步数，并确保样品在上下方向均完全模糊。
   1. 使用与显微镜配套的软件（参见材料表）来控制显微镜。
   2. 使用显微镜的调焦旋钮将焦点置于细胞中部。在ND采集模式下，勾选Z框以采集z轴层扫图像。点击“Home”按钮，将细胞中部设为起始点。将步进大小设为0.1 µm，范围设为4 µm。确保Z轴装置设置为压电载物台。
   3. 在Lambda窗口中设置荧光通道，使其与所成像的荧光分子相匹配。本实验中使用了GFP和mCherry。
      注意： 若需获取额外荧光通道的三维分布，应在第二个颜色通道中以相同的步进大小和范围再采集一组z轴层扫图像。本实验中，使用细胞质mCherry确定细胞形态，MreB-GFP作为第二荧光通道。
   4. 确保实验顺序设置为lambda（z序列），以便在切换通道前完成每个颜色通道的完整z轴层扫。
   5. 点击“Run Now”开始图像采集，并在完成一个或两个z轴层扫后保存文件。
   6. 移动至垫片上的新区域，重复步骤1.2.2–1.2.5。

2. 细胞重建

1. 裁剪单个细胞，并将图像保存为堆叠的 TIFF 文件，确保每个文件仅包含一个细胞。确保该细胞与其他细胞充分分离（即在 xy 平面上距离其他细胞约 5 倍于模糊函数半高全宽的距离）。
   注意：此步骤可使用免费的图像分析软件完成（参见材料表）。
   1. 在单个细胞周围绘制一个方框，并将该细胞复制两次，每个通道一次。确保勾选“复制超堆栈”选项框，并将通道分别设置为 1 或 2，同时确保切片包含完整的 z 堆栈。
      注意：如果仅对细胞形态成像而不包括额外的荧光蛋白，则仅存在一个通道。
   2. 当两个堆栈均可用后，进入 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接，将蛋白通道图像置于前面、形态通道图像置于后面进行合并。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	sigma-Aldrich	A9539
棉签	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	用于涂抹 VaLaP
盖玻片	VWR	16004-302
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc	用于裁剪细胞图像
羊毛脂	Sigma-Aldrich	L7387	与石蜡和凡士林混合制备 VaLaP
LB 培养基	BD Difco	DF0446173
M63 培养基	US Biological	M1015
MATLAB	Mathworks		运行前向卷积脚本所需
显微镜载玻片	Fisher	12-550-133
NIS 元素	Nikon
石蜡	Sigma-Aldrich	327212
凡士林	Equate	49035-038-27
压电 Z 轴载物台	Nikon	77011589
移液器吸头 -p200	USA Scientific	1111-0730
移液器吸头 -p10	USA Scientific	1111-3730