量化感染 Vibrio cholerae 的斑马鱼肠道细菌载量

摘要

来源：Nag, D., 等 利用成年斑马鱼模型定量分析霍乱弧菌定植与腹泻。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种定量成年斑马鱼肠道细菌载量的实验方案，这些斑马鱼感染了耐抗生素的霍乱弧菌（Vibrio cholerae）菌株。在实施安乐死后进行解剖，分离肠道组织，利用玻璃珠将其匀浆以释放其中的细菌。将所得匀浆液接种至选择性培养基上，通过计数表达β-半乳糖苷酶的蓝色菌落，评估细菌负荷量。

方案

1. 肠道定植水平的测定

注意：在斑马鱼模型中，肠道定植是最具参考价值的指标，可用于比较不同霍乱弧菌菌株的相对适应性，或评估突变及基因敲除的影响。

1. 安乐死

1. 当实验达到预期终点时，取感染水样（通常 15 mL 已足够），用于测定排出的细菌数量以及腹泻相关指标（如黏蛋白检测、蛋白质含量和/或光密度），如有需要。

2. 将剩余的水通过渔网（以收集鱼类）倒入漂白剂中，以杀灭水中的霍乱弧菌（V. cholerae）。

3. 将鱼放入含有感染水和 336 µg/mL 三卡因甲磺酸盐（Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate，三卡因）的烧杯中，在室温下于该三卡因溶液中孵育 20 分钟。 
注意：鱼网已用 10% 次氯酸钠溶液灭菌。

2. 解剖

1. 鱼类的准备

1. 用一次性塑料勺从三卡因溶液中捞出一条鱼，并将其放置在解剖表面上。

2. 将鱼腹面朝上放置，用大头针穿过其下颌，针的钝端朝向身体中心的反方向倾斜。在肛门后方不远处再放置一枚大头针，同样使其朝向身体的反方向倾斜。

2. 暴露肠道

1. 用浸有70%乙醇的无绒布擦拭鱼的腹面。

2. 将手术刀和Vannas剪刀浸入70%乙醇中消毒，然后用火焰灼烧灭菌。

3. 使用手术刀穿透鳞片，在皮肤正下方沿腹部纵向做一个小切口。注意不要切得太深，因为肠管位于皮肤正下方。

4. 使用剪刀沿身体长度方向小心地延长切口，切割深度不得超过皮肤层，并避免损伤肛门。

5. 用剪刀向鱼头方向做两个侧向切口，以扩大切口开口。

6. 将侧切口两侧的皮肤用大头针固定在解剖表面上，针尖向外倾斜，远离身体。

注意： 针尖此前已通过酒精火焰灼烧进行灭菌。

3. 去除肠道

注意：肠道应可见为位于其他器官上方的一条苍白且非常细的管状结构。

1. 将镊子进行火焰灭菌，然后用其取出整个肠道（通常长度为 12–15 mm）。将肠道放入含有玻璃珠（参见步骤 1.3.1–1.3.2）和 1 mL 1× PBS 或 LB 的匀浆管中，并置于冰上。

3. 匀浆化

1. 提前准备匀浆管，将约 1.5 g 的 1 mm 玻璃珠加入 2 mL 螺旋盖管中（填充至约一半），然后通过高压灭菌进行消毒。

2. 加入 1 mL 无菌 LB 或 1× PBS。

3. 将斑马鱼肠道加入离心管（步骤 1.2.3.1）后，务必拧紧管盖，然后将离心管固定在涡旋振荡器中。

4. 在最高档位下匀浆样品1分钟，然后在冰上冷却1–2分钟。重复此匀浆循环一次，以实现完全匀浆。注意：多种其他匀浆方法也可行。

4. 定量分析肠道定植水平

1. 准备试管（小型玻璃试管或1.5 mL微量离心管），用于肠道匀浆液的系列稀释，每管加入900 µL LB培养基或1× PBS缓冲液。每条鱼准备5–6个试管，加入100 µL匀浆液至第一管，充分涡旋混匀，然后从第一管取100 µL转移至第二管，依次进行10倍系列稀释。

2. 重复此步骤，直至完成所有稀释液的配制。

将每种稀释液取 100–200 µL 涂布于含有 100 µg/mL 链霉素（若使用链霉素抗性菌株）和 40 µg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）的 LB 琼脂平板上。在 30 °C 下孵育平板 16–18 小时。

4. 过夜培养后，使用自动菌落计数器或手动计数平板上的霍乱弧菌菌落；用记号笔标记已计数的菌落有助于避免重复或遗漏。

5. 根据平板计数乘以悬液的稀释倍数，并考虑涂布的体积，计算每条鱼肠道中的菌落形成单位（CFU）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
摇床培养箱	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
培养箱	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
分光光度计	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
涡旋振荡器	Minibeadbeater24	112011
电子天平	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
加热搅拌器	Corning, Corning, NY	PC-420D
本生灯
自动菌落计数器	REVSCI	120417B
材料
400 ml 玻璃烧杯	Pyrex
带孔盖子	移液枪头盒中的带孔枪头架
一次性塑料勺	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
鱼缸系统	Aquaneering, San Diego, CA
反渗透水净化器	Aqua FX	TK001
鱼网	Marina
鱼饲料	Tetra fin
卤虫	Red jungle 品牌	O.S.I. pro 80
泡沫板
大头针
手术刀	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
镊子	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas 剪刀	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml 螺口管	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm 玻璃珠	Bio Spec	11079110
涂布用玻璃珠	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
培养皿	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml 离心管	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml 离心管	Corning Falcon, Corning, NY	352098
试管	Pyrex	9820
玻璃移液管	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
微量移液器	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
吸头	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
化学试剂
Instant Ocean 盐
磷酸盐缓冲液	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma, St. Louis, MO	A5040
LB 培养基
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
琼脂	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS 琼脂	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS 琼脂	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
软件
Microsoft Office
Prism 5