肠道定植与腹泻诱导 霍乱弧菌 在成年斑马鱼中

摘要

来源： Nag, D., 等。 量化 霍乱弧菌 成年斑马鱼模型中的定植与腹泻研究 J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了将致病性霍乱弧菌（Vibrio cholerae）菌株接种至成年斑马鱼体内，以研究其肠道定植及疾病发生情况。视频展示了细菌毒素如何破坏肠道完整性，导致液体渗漏、黏液分泌以及水样腹泻，随后对斑马鱼进行进一步分析前的处理过程。

方案

1. 斑马鱼浸入式接种
   注意： 这种暴露方式类似于自然感染过程。
   1. 制备 霍乱弧菌
      1. 接种一环分离的菌落至5 mL LB培养基中 V. cholerae 从LB平板上挑取单菌落，置于37 °C、180 rpm振荡培养6–8小时（过夜培养）。
      2. 在250 mL锥形瓶中加入25 mL新鲜的高压灭菌LB培养基，并接种50 µL上述过夜培养物。在37 °C、150 rpm振荡条件下培养16–18 h。
      3. 在600 nm处读取光密度（OD）₆₀₀) 1/10 稀释度的过夜培养物，以估算每毫升的细菌数量（OD₆₀₀ = 1 约为 10⁹ CFU/mL
      4. 以6,000 g离心10分钟收集细胞。用移液器吸除培养基或将培养基倒入消毒液中。用无菌PBS将细胞重悬至所需浓度，通常为1 × 10⁶至1 × 10⁸个细胞/mL。⁷ 至 1 × 10¹⁰ 每毫升 PBS
         注意： 此处，我们将含有60 mg/L海盐的经高压灭菌反渗透水称为无菌感染用水。
   2. 接种与培养
      1. 将四到五条斑马鱼放入含有200 mL无菌感染用水的400 mL烧杯中。
      2. 加入1 mL的 V. cholerae 以获得所需的感染浓度（通常为 5 x 10⁴ 至 5 × 10⁷ CFU/mL）于200 mL感染水中。
      3. 用带孔的盖子盖住烧杯，以防止鱼跳出；200 µL吸头盒的盖子顶部可用于此目的。
      4. 为每个烧杯贴上标签，并将其放入设定为 28 °C 的玻璃门培养箱中，在整个实验过程中保持此条件。
   3. 瞬时暴露操作步骤
      注意： 短暂暴露于 V. cholerae （通常为6小时）后移除接种细菌，有助于研究细菌传播，并更准确地定量排出的细菌。
      1. 暴露6小时后，通过渔网将烧杯中的水倒出以收集鱼类。将感染性液体倒入含漂白剂的容器中以灭活 V. cholerae.
      2. 将取出的鱼放入盛有200 mL无菌感染水的烧杯中。让鱼在该清洁水中游动5分钟，以去除鱼体表的细菌。
      3. 重复网捞操作，将鱼放入装有200 mL无菌感染水的新烧杯中。在整个实验期间，将鱼保留在该烧杯中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
培养箱	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
材料
400 ml 玻璃烧杯	Pyrex
带孔盖子	移液枪头盒中的带孔枪头架
鱼缸系统	Aquaneering, San Diego, CA
反渗透水净化器	Aqua FX	TK001
捞鱼网	Marina
鱼饲料	Tetra fin
培养皿	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml 离心管	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
试管	Pyrex	9820
微量移液器	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
枪头	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB 培养基
胰蛋白胨	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
酵母提取物	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
琼脂	BD Biosciences, San Jose, CA	214010