细菌暴露后对 C. elegans 肠道通透性的评估

摘要

来源： Le, T. A. N., 等测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫. 视频实验杂志 (2019)

本视频展示了一种基于荧光的检测方法，用于定量暴露于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道通透性。与喂食大肠杆菌（Escherichia coli）的对照组相比，经病原体处理的线虫体内荧光染料渗漏至体腔的程度增加，表明其上皮屏障受到损伤。

方案

1. 用于检测不同细菌对线虫肠道通透性影响的线虫生长培养基（NGM）平板的制备 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫

1. 在500 mL玻璃瓶中加入1.25 g蛋白胨、1.5 g NaCl、8.5 g琼脂、一个磁力搅拌子和487.5 mL蒸馏水。
2. 充分混合，于121 °C高压灭菌15分钟，然后在水浴中冷却至55 °C，持续30分钟。
3. 将培养基从水浴中取出，向NGM中加入各组分（0.5 mL 1 M CaCl₂、0.5 mL胆固醇（溶于无水乙醇）、0.5 mL MgSO₄、12.5 mL KPO₄），并充分混匀。
   注意： 所有组分均需高压灭菌，胆固醇除外（溶于无水乙醇），所有实验步骤均须在洁净台内进行。
4. 将20 mL NGM分装至每个90 × 15 mm的培养皿中，在室温（约20 °C）下的洁净台中静置，使琼脂凝固。NGM平板可在4 °C保存最多一个月。
   注意： 实验流程可在此暂停。用于FITC-葡聚糖（异硫氰酸荧光素标记葡聚糖）染色的NGM平板已制备完成。将10 mL NGM分装至每个60 × 15 mm培养皿中，在室温（约20 °C）下的洁净台中静置凝固。
5. 从4 °C冰箱中取出细菌培养物，充分涡旋混匀后，将其均匀涂布于NGM平板上。
6. 每块新鲜NGM平板中加入共800 µL细菌培养物，置于20 °C培养箱中过夜干燥。
   注意： 在第一次实验（图1）中，准备了两块接种E. coli OP50的NGM平板、一块接种P. aeruginosa PAO1的NGM平板和一块接种E. faecalis KCTC3206的NGM平板。在第二次实验（图2）中，准备了两块接种活体E. coli OP50的NGM平板、一块接种活体P. aeruginosa PAO1的NGM平板和一块接种热灭活P. aeruginosa PAO1的NGM平板。

3. 制备年龄同步化的C. elegans

1. 在固体 NGM 平板上培养线虫，并用 E. coli OP50 喂养，直至达到所需种群数量。
2. 采用定时产卵法或次氯酸钠溶液处理法对卵进行同步化。

4. 细菌处理与FITC-葡聚糖饲喂

1. 在添加了活体微生物的NGM平板上，将年龄同步的卵于20 °C培养64小时 E. coli 以OP50作为食物
2. 用S缓冲液洗涤同步化至L4期的幼虫，并将500条以上线虫转移至含有不同细菌和化学物质的处理用NGM平板。在20 °C条件下培养48 h。
   注意： 处理时间可根据所用细菌和化学物质的不同，介于24至72小时之间。DIM的治疗或预防效果也可通过以下方式评估：先用病原体预处理线虫，再用DIM处理线虫（评估治疗效果）；或先用DIM预处理线虫，再用病原体处理（评估预防效果）。
3. 为制备含FITC-葡聚糖的培养板，将2 mL热灭活的 E. coli OP50 加入 4 mg FITC-葡聚糖。然后，将 100 µL FITC-葡聚糖均分 E. coli 将OP50混合物加入二十个新的NGM琼脂平板（60 mm × 15 mm）中，并在洁净台中干燥1小时。
   注意： 每个NGM平板中FITC-葡聚糖的终浓度为20 μg/mL。
4. 准备五个 E. coli 不含FITC-葡聚糖的OP50 NGM平板用于溶剂对照处理。为此，取100 µL热灭活的 E. coli 每块新的NGM琼脂平板（60 mm × 15 mm）上接种OP50，在洁净台中晾干1小时。
   注意： 每次独立实验需要十五个添加了FITC-葡聚糖的NGM平板和五个未添加FITC-葡聚糖的NGM平板。
5. 在处理48小时后（自步骤7.2起），用S缓冲液洗涤线虫，将线虫转移至添加FITC-葡聚糖的培养板以及不含FITC-葡聚糖的NGM培养板中，于培养板中过夜孵育（14–15小时）。
   注意： 每个处理组需要进行5次FITC-葡聚糖染色（或溶剂对照喂养）重复实验。
6. 用S缓冲液清洗线虫，然后将其转移至新鲜的NGM琼脂平板上爬行1小时。
   注意： 每次独立实验共需要 20 个新鲜的 NGM 平板。在此步骤中，可使用添加或未添加补充成分的 NGM 平板 E. coli OP50
7. 向黑色96孔平底板的每个孔中加入50 µL 4%甲醛溶液。从每块NGM平板中转移约50条线虫至各孔，用于荧光检测。1至2分钟后，彻底移除各孔中的甲醛，并加入100 µL封片介质以覆盖孔壁。
   注意： 4% 甲醛溶液用于固定和 immobilize 线虫。每个处理组使用 5 个孔（5 个重复）进行图像分析。

5. 成像 秀丽隐杆线虫 使用Operetta成像系统通过检测FITC-葡聚糖荧光吸收测定肠道通透性

注意： 可使用荧光体视显微镜进行图像分析，以替代 Operetta 系统。

1. 使用 Operetta 高内涵成像系统捕获荧光图像并测量荧光强度，并通过 Harmony 软件分析图像。
2. 在 Harmony 软件中，点击图标 Open lid 打开盖板，将培养板放入仪器中。
3. 设置参数。
4. 点击 Set up，选择培养板类型（96 孔 Corning 平底板），并添加通道（明场和 EGFP 通道）。
5. 调整布局。进入 Layout selection，选择 Track 并调整参数（第一张图像位于 1 µm，共 10 个层面，层间距为 1 µm）。
6. 选择一个处理孔和一个成像视野，在 Run experiment 部分点击 Test，检查图像是否满意。
7. 若图像满意，返回 Set up 部分，点击屏幕末尾的 Reset 图标，然后选择所有目标孔及适当数量的成像视野。
8. 再次进入 Run experiment，输入培养板名称，点击 Start 开始运行。
9. 为测量荧光强度，进入图像分析部分并导入图像。通过选择 EGFP（增强型绿色荧光蛋白）通道和方法 B 来识别细胞。将公共阈值调整为 0.5，面积设为 >200 µm²，分离因子设为 3.0，个体阈值设为 0.18，对比度设为大于 0.18。然后计算强度属性，并选择“平均值”作为输出。点击 Apply 图标以保存设置。
10. 进入 Evaluation 部分，通过生成热图和数据表来测量强度。将 Readout parameter 设置为 Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well，然后开始评估。
    注意： 此处可暂停本方案。
11. 要从 Operetta 中导出数据，请点击 Setting 按钮并选择 Data management。
12. 选择 Write archive，然后点击浏览并选择文件。
13. 为选择文件，点击左上角的小 + 符号，然后点击 Measurement 并选择 Plate name。
14. 选择文件后点击 OK。
15. 通过点击活动路径中的 Browse 按钮，选择保存文件的路径。
16. 点击 Start 以保存数据文件。
    注意： 此处可暂停本方案。

结果

图1：不同细菌对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫 线虫的显微图像，包括明场、FITC荧光（绿色通道）以及合并图像。（来自线虫的显微图像A) E. coli OP50 未喂食 FITC-葡聚糖，（B) E....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
90×15 mm 培养皿	SPL Life Sciences, 韩国	10090
60×15 mm 培养皿	SPL Life Sciences, 韩国	10060
Bactor 琼脂	Beckton Dickinson	REF. 214010
甲醛溶液	Sigma	F1635
脑心浸出液（BHI）	Becton Dickinson	REF. 237500
Caenorhabditis elegans N2	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）		野生型
Costa 检测板，96 孔黑色带透明平底未处理聚苯乙烯板，无盖	Corning Incorporated	REF. 3631
Escherichia coli OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	Sigma	FD10S
Harmony 软件	PerkinElmer		版本 3.5
LB 培养基（Luria-Bertani）	Merck	VM743185 626 1.10285.5000
七水合硫酸镁	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount 水性封片剂	Sigma	F4680
Operetta CLS 高内涵分析系统	PerkinElmer	HH16000000
蛋白胨	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	韩国典型培养物保藏中心	KCTC NO. 1637
氯化钠	Fisher Bioreagents	BP358-1
体视显微镜	Nikon, 日本	SMZ800N
酵母提取物	Becton Dickinson	REF. 212750