慢性肠道感染小鼠模型中组织细菌负荷的定量化

Abstract

资料来源： Lo， B. C. 等人。慢性沙门氏菌感染诱发肠道纤维化。 J. Vis. Exp. （2019）

该视频展示了在小鼠模型中对慢性感染链霉素抗性 沙门氏菌（Salmonella typhimurium ）细菌负荷的定量化。安乐死和无菌解剖后，会采集盲肠和脾脏组织，用钢珠均质释放细菌，并连续稀释。稀释液被镀在选择性琼脂上，并计数可见菌落以估算肠道和全身部位每克组织的细菌负荷。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审查。

1. 用于小鼠口服胃囊的沙门氏菌Typhimurium ΔAroA培养的制备

1. 从冷冻的 S. Typhimurium ΔAroA甘油库存中，用含有100 μg/mL链霉素的Luria-Bertani琼脂（LB琼脂）制备一条条线板，并配有无菌接种环。在37°C下孵育一夜。条纹盘可在4°C下保存最长一周。
2. 感染前一天，将0.5克链霉素溶于2.5毫升水中制备抗生素。在对链霉素溶液进行过滤消毒后，用带球形的22克肠针和1毫升注射器，注入100微升链菌素溶液（每剂20毫克链霉素），口服给小鼠进行胃管处理。使用接种环，在培养管中与单一菌落接种3毫升LB肉汤（50 μg/mL链霉素）。 在 37°C的有氧培养下，以每分钟200转（RPM）振动，进行有氧培养。
3. 感染当天，通过在无菌磷缓冲生理盐水（PBS）中连续两次1/10稀释沙 门氏菌 培养液，准备最终感染剂量。这将形成一个约100微升的接种物，内含约3个×106个菌落形成单元（CFU）。
4. 使用带球形的22克胃肠针和1毫升注射器，将每只小鼠吸入100微升的 沙门氏菌。
   注意： 使用无菌技术制备 沙门氏菌 培养物。通过在LB琼脂上连续稀释链霉素进行镀层，可以验证沙 门氏菌 的最终接种浓度。

2. 组织中沙门氏菌负荷的评估

1. 准备2毫升安全锁圆底微管，内含1毫升无菌PBS和高压消毒不锈钢珠。在组织采集前先称重管子。
2. 切除因二氧化碳暴露而安乐死的小鼠的盲肠和脾脏组织。从单个动物身上收集组织，分别用不同的管子。称重管子以确定组织重量。
3. 使用搅拌机设备在30 Hz频率下均质15分钟。每孔将900微升PBS转移到96孔的2毫升超量块中。将100微升组织均质液移入第一孔，混合后通过向后续孔添加100微升进行连续稀释，直到得到10⁻⁶稀释。将每种稀释品10微升三份装在含有100 μg/mL链霉素的LB琼脂上。
4. 计数并将平均CFU乘以100倍，因为已对1000微升样品进行了电镀，并使用了相应的稀释因子。将组织总CFU除以组织重量，即可确定每克组织的CFU。
   注意： 组织处理期间，所有样本保持冰封或4°C。在连续稀释时使用宽孔移液器头。提前准备包含PBS的96口巨型块。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2毫升圆底保险锁管	埃彭多夫	22363344
不锈钢珠	奇根	69989
PBS	吉布科	10010031
大孔吸管头	费舍尔	2707134
2 mL 超块板	萨斯泰特	82.1972.002
加维奇针	FST	18061-22
链霉素硫酸盐	西格玛	S9137
搅拌机	雷奇	嗯