小鼠慢性肠道感染模型中组织细菌载量的定量分析

本文内容

摘要

该视频展示了在链霉素耐药细菌慢性感染的小鼠模型中，细菌载量的定量方法 沙门氏菌 typhimurium 安乐死后进行无菌解剖，采集盲肠和脾脏组织，使用钢珠均质化以释放细菌，并进行系列稀释。将稀释液接种于选择性琼脂平板，计数可见菌落，以估算肠道及全身组织每克中的细菌载量。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备 沙门氏菌 小鼠口服灌胃用鼠伤寒沙门氏菌ΔAroA培养物

从一管冻存的甘油菌种中 S. 鼠伤寒沙门氏菌 ΔAroA，使用含100 μg/mL链霉素的LB琼脂培养基（Luria-Bertani琼脂），用无菌接种环划线接种。37 °C过夜培养。划线平板可在4 °C保存最多一周。
感染前一天，将0.5 g链霉素溶解于2.5 mL水中配制抗生素溶液。经滤膜除菌后，使用带橡胶头的22G灌胃针和1 mL注射器，对小鼠进行口服灌胃，每只给予100 μL链霉素溶液（每剂量含链霉素20 mg）。用接种环取单个菌落，接种至含3 mL LB液体培养基（含50 μg/mL链霉素）的培养管中。孵育 沙门氏菌 37 °C、200 转/分钟（RPM）振荡培养，有氧过夜培养。
在感染当天，通过将过夜培养物连续进行两次1/10稀释，制备最终感染剂量 沙门氏菌 在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中培养，制备成终体积为100 μL的接种液，其中约含3 × 10⁶菌落形成单位（CFU）。
使用带有橡胶球头的22G灌胃针和1 mL注射器，对每只小鼠灌胃100 μL已配制好的溶液 沙门氏菌
注意： 准备 沙门氏菌 使用无菌技术进行培养。最终接种浓度为 沙门氏菌 可通过在含链霉素的LB琼脂平板上进行连续稀释涂布来验证。

2. 评估 沙门氏菌 组织中的负担

准备 2 mL 安全锁圆底微量离心管，每管加入 1 mL 无菌 PBS 和一个经高压灭菌的不锈钢珠。在组织采集前预先称量各管重量。
对经二氧化碳暴露安乐死的小鼠，切除其盲肠和脾脏组织。将不同个体动物的组织分别收集至不同的离心管中。称量各管以确定组织重量。
使用混合研磨仪在 30 Hz 条件下匀浆 15 分钟。在 96 孔 2 mL 大容量深孔板中，每孔加入 900 μL PBS。用移液器将 100 μL 组织匀浆液加入第一孔，充分混匀，然后通过向后续各孔依次加入 100 μL 进行连续稀释，直至获得 10⁻⁶ 稀释度。取每种稀释液 10 μL，每种设三个重复，点种于含有 100 μg/mL 链霉素的 LB 琼脂平板上。
计数菌落后，将平均菌落形成单位（CFU）乘以 100 的校正因子（因点种的是 1000 μL 样品中的 10 μL），再乘以相应的稀释倍数。将组织总 CFU 除以组织重量，计算每克组织中的 CFU 数量。
注意：组织处理过程中所有样品均需保持在冰上或 4 °C。使用组织匀浆液进行连续稀释时，应使用宽口移液器吸头。提前准备好含有 PBS 的 96 孔大容量深孔板。

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材料

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