制备用于建立小鼠复发性尿路感染模型的Gardnerella vaginalis接种物

摘要

来源：O'Brien, V.P. 等 复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术 J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了制备一种 Gardnerella vaginalis 用于建立小鼠复发性尿路感染模型的接种物

方案

1. 准备 Gardnerella vaginalis 接种物
   注意：所有步骤均在厌氧环境中进行。不同 G. vaginalis 菌株的理想培养时间有所不同，某些菌株可能比其他菌株更早进入稳定期甚至开始死亡。因此，在小鼠实验前，应针对特定菌株通过实验确定其最佳培养时间。目前尚不清楚其他或所有 G. vaginalis 菌株是否会在该模型中引发相同效应。
2. 将 G. vaginalis 菌株从 -80 °C 冻存管中划线接种至 NYCIII 平板（不含抗生素），在 37 °C 厌氧条件下培养 24 小时。
3. 在厌氧环境中，用 1 μL 接种环（单个菌落不足以接种）从 NYCIII 平板取菌，接种至 5 mL 厌氧 NYCIII 培养基中，并在 37 °C 厌氧条件下静置培养 18 小时。培养基中不得添加抗生素。
4. 使用分光光度计测定培养物的 OD⁶⁰⁰
   1. 取一定体积（X）的培养物，在 9600 × g 离心 1 分钟，吸除上清液。根据以下公式计算所需磷酸盐缓冲液（PBS）的体积（Y），以重悬菌体沉淀至目标接种物光密度（OD），使 50 μL 接种液中含有 10⁸ 菌落形成单位（CFU）：X mL × ODᶜᵘˡᵗᵘʳᵉ = Y mL × OD ^inoculum，求解 YY = (X ml × ODᶜᵘˡᵗᵘʳᵉ) / OD ^inoculum
      注意：JCP8151B^SmR 菌株的 OD ^inoculum 为 5，但其他 G. vaginalis 菌株需通过实验确定该值。例如，若取 3 mL 过夜培养的 JCP8151B^SmR 菌液（ODᶜᵘˡᵗᵘʳᵉ = 2.0），则 Y = (3 mL × 2.0) / 5.0；因此，应将菌体沉淀重悬于 1.2 mL PBS 中。
   2. 将细菌沉淀用 PBS 重悬至目标浓度。对接种物进行系列稀释并涂布平板，以确定每次实验实际使用的接种剂量。切勿仅依赖 OD 值进行估算。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖	Sigma	G7528	用于NYCIII培养基中G. vaginalis的生长
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Cellgro	25-060-Cl	用于NYCIII培养基中G. vaginalis的生长
氯化钠	Sigma	S3014	用于NYCIII培养基中G. vaginalis的生长
蛋白胨#3	Fisher	DF-122-17-4	用于NYCIII培养基中G. vaginalis的生长
酵母提取物	Fisher	DF0127-17-9	用于NYCIII培养基中G. vaginalis的生长
分光光度计	BioChrom	80-3000-45	用于测定细菌OD600
链霉素	Gibco	11860038	添加至G. vaginalis NYCIII选择性平板（1 mg/mL）