小鼠共感染模型中感染组织的处理及细菌计数

摘要

来源： Lenhard, A., 等 一种小鼠模型用于研究转变过程 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程 视频实验杂志 (2022)

本视频展示了对感染了致病性细菌和病毒的共感染小鼠肺组织的处理过程。通过剪碎、匀浆和接种肺组织，可定量分析细菌载量，从而判断细菌在肺部的扩散情况及疾病的严重程度。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 感染组织的处理与细菌计数

1. 肺组织采集
   1. 使用解剖剪在暴露的肋骨两侧剪开，轻轻将肋骨向上提起朝向小鼠头部，以暴露心脏。将连接在预装有磷酸盐缓冲液（PBS）的10 mL注射器上的25 G针头插入右心室，开始缓慢灌注。观察肺组织是否出现漂白现象，作为灌注成功的指标。冲洗过程应缓慢进行，以避免破坏肺组织。
   2. 用镊子提起心脏，并剪开以分离肺和心脏。分离后，用镊子夹起所有肺叶，在盛有无菌PBS的培养皿中冲洗，以去除残留血液。在培养皿中将肺组织切成小块并充分混匀。取出一半肺组织混合物用于测定细菌菌落形成单位（CFU）或病毒蚀斑形成单位（PFU），将其放入已预装0.5 mL PBS的圆底15 mL离心管中，用于后续匀浆。 
      注意：不应从同一肺的不同肺叶分别取样进行不同检测。相反，所有肺叶应先切碎并充分混合，然后均等地分配至各项检测中。
2. 为匀浆采集的组织，首先用70%乙醇清洗匀浆探头，将匀浆仪以60%功率开启30秒。随后在无菌水中重复清洗10秒。每份组织匀浆1分钟。每处理一个样本后，用无菌水清洗匀浆探头；每处理一个器官或样本组之间，需在新的70%乙醇管中清洗探头。
3. 细菌数量测定
   1. 所有器官采集并匀浆完成后，将系列稀释液接种至血琼脂平板上。为计算总CFU，使用10 µL进行涂布，并记录每份样本的最终体积（mL）。于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带鲁尔锁扣头的一次性注射器（1 mL）	Fisher	14-823-30
Fisherbrand 精细解剖剪	Fisher	08-951-5	用于取材的器械
Fisherbrand 解剖组织镊	Fisher	13-812-38	取材用镊子
Fisherbrand 一次性无菌注射器（10 mL）	Fisher	14-955-459