生成具有屏障功能的人类结肠类器官单层以研究宿主-病原体相互作用

摘要

来源：In, J. G.,等. 利用人类结肠类器官单层培养研究病原体、共生菌与宿主肠上皮之间的相互作用. J. Vis. Exp. (2019).

本视频演示了在胶原蛋白包被的Transwell系统中培养结肠来源上皮细胞的方法，以构建可产生黏液的单层细胞模型，模拟肠道屏障，并用于宿主-病原体相互作用研究。

方案

1. 接种类肠体/类结肠体悬液

1. 若包被的插入式培养皿储存于 4 °C，请在 37 °C/5% CO₂ 条件下平衡₂ 细胞接种前，将组织培养孵育箱预热至少30分钟。
2. 对于每种待铺板的插入片段，准备 1 mL 温热（25–37 °C）的扩增培养基（EM），并加入 10 μM Y-27632 和 10 μM CHIR 99021。
   注意： EM 由高级 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）/F12 组成，其中包含 B27（1×）、50% WNT3A 条件培养基、15% RSPO1 条件培养基、10% Noggin 条件培养基、50 ng/mL 人 EGF（Epidermal Growth Factor）、500 nM A-83-01、10 μM SB 202190、抗生素/抗真菌素混合液（1×）、10 mM HEPES（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)）、L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽（1×）和青霉素-链霉素（1×）（参见 材料表).
3. 吸出含有细胞沉淀的离心管中的洗涤液，并加入适量的EM重悬细胞，确保每孔插入物至少有100 μL。
4. 吸出每个小室中的IV型胶原溶液，并用洗涤液对每个小室各洗涤两次，每次150 μL。
5. 将600 μL的EM加入每个插入物下方的空间。
6. 将100 μL细胞悬液移液至每个插入孔中。
7. 将培养板放回组织培养孵育箱中，静置至少12小时。
   注意： 避免振荡或剧烈倾斜培养板，以防类器官碎片在插入膜上分布不均。
8. 将培养板置于相差显微镜下，使用2.5x–10x物镜观察细胞贴壁与铺展情况，直至形成融合的单层细胞。
9. 1至2天后，大多数细胞碎片应已黏附于胶原基质上。此时更换培养基，并停止使用Y-27632和CHIR 99021。此后每2至3天更换一次培养基，直至细胞融合。通常在7至10天内达到融合状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇	Sigma	T4661	Tris 碱，裂解缓冲液组分
A-83-01	Tocris	2939	ALK4/5/7 抑制剂
冰醋酸	Fisher Scientific	A38
高级 DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	生长培养基组分
抗生素/抗真菌剂混合液	Invivogen	ant-pm-2	Primocin（100 倍浓缩液）
B27（50 倍浓缩液）	Life Technologies	17504-044	生长培养基组分
细胞培养小室	Corning	3470	Transwell，PET 膜，0.4 μm 孔径，24 孔板
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β 抑制剂
IV 型胶原蛋白（来源于人胎盘）	Sigma	C5533
Cultrex 类器官收获溶液	Trevigen	3700-100-01	降解基底膜基质
无水乙醇	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，200 mM
HEK293T/Noggin-Fc 细胞系	van den Brink 实验室，Tytgat 肝脏与肠道研究研究所		用于制备 Noggin 条件培养基
HEK293T/RSPO1-Fc-HA 细胞系	Trevigen	3710-001-K	用于制备 R-spondin-1 条件培养基
HEPES（1 M）	Life Technologies	15630-080	生长培养基组分
人表皮生长因子（EGF）	R&D Systems	236-EG-01M	生长培养基组分
倒置细胞培养光学显微镜	Olympus	CKX51
L-WNT3A 细胞系	ATCC	CRL-2647	用于制备 Wnt3a 条件培养基
Matrigel（生长因子减少型）	Corning	356231	用于三维培养的基底膜基质
小型细胞刮刀	United BioSystems	MCS-200
MUC2 抗体，小鼠单克隆	Abcam	ab11197	免疫染色使用比例为 1:100，免疫印迹使用比例为 1:500
MUC2 shRNA 慢病毒颗粒	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ 慢病毒 shRNA，编号：4583
轨道摇床	Grant Instruments	PSU-10i
青霉素-链霉素（100 倍浓缩液）	Life Technologies	15140-122	生长培养基组分
带微探头的超声破碎仪	Branson Ultrasonics	450
哺乳动物细胞蛋白酶抑制剂混合液	Sigma	P8340	裂解缓冲液组分
SB 202190	Tocris	1264	p38 MAPK 抑制剂
氯化钠	Sigma	S3014	裂解缓冲液组分
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750	裂解缓冲液组分
十二烷基硫酸钠	Sigma	L3771	裂解缓冲液组分
TrypLE Express（1 倍浓度）	Life Technologies	12605-010	胰蛋白酶，用于消化肠类器官/结肠类器官片段
维甲蛋白抗体，兔单克隆	Abcam	ab129002	免疫印迹使用比例为 1:1000
水（组织培养级，无菌过滤）	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	RhoA/ROCK 抑制剂