生成具有屏障功能的人类结肠单分子层以研究宿主-病原体相互作用

摘要

来源：J. G. In等人。人类结肠单层研究病原体、共生体与宿主肠道上皮之间的相互作用。J. Vis. Exp.（2019年）。

本视频演示了在胶原蛋白涂层Transwell系统中培养结肠来源上皮细胞的过程，以生成产生粘液的单层，该单层模拟肠道屏障并支持宿主与病原体的相互作用研究。

方案

1. 对肠/结肠悬浮液进行装甲

1. 如果涂层插入物储存在4°C，则在细胞板前至少在37°C/5%_CO2 组织培养箱中保持平衡状态30分钟。
2. 每个要镀层的插入件，准备1毫升温热（25-37°C）膨胀介质（EM），并加入10微米Y-27632和10微米CHIR 99021。
   注意： EM由含B27的高级DMEM（杜尔贝科改良鹰培养基）/F12（1x）、50% WNT3A调质培养基、15%RSPO1调质基、10%Noggin调质基、50 ng/mL人表皮生长因子（表皮生长因子）、500 nM A-83-01、10 μM SB 202190、抗生素/抗真菌药组合（1x）、10 mM HEPES（N-（2-羟基）哌吡嗪-N'-（2-乙磺酸））组成。 L-丙酰-L-谷氨酰胺二肽（1x）和青霉素-链霉素（1x）（见 材料表）。
3. 从装有细胞沉淀的管子中抽取洗涤介质，并以足够体积的电磁电磁液重新悬浮，以产生至少100 μL/insert。
4. 从每个插入片抽取胶原蛋白IV溶液，并用150微升洗涤介质洗涤两次。
5. 在每个插入点下方的空间中注入600微升电磁吸液。
6. 将100微升细胞悬浮液移液管移入每个插入片段。
7. 将平板放回组织培养箱，静置至少12小时不动。
   注意： 避免摇晃或急剧倾斜板，以防止结肠碎片在插入膜上的分布不均。
8. 通过将板片放置在相差光学显微镜下，搭配2.5x-10倍物镜，监测细胞附着和扩散形成汇聚单分子层的情况。
9. 1-2天后，大多数碎片应附着在胶原基质上。重新培养培养基，停止使用Y-27632和CHIR 99021处理。每2-3天持续更新培养基，直到完全汇合。汇合通常需7至10天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇	西格玛	T4661	Tris 碱基，裂解缓冲液的组成部分
A-83-01	托克里斯	2939	ALK4/5/7抑制剂
醋酸，冰川	费舍尔科学	A38
高级DMEM/F12	生命科技	12634-010	培养基的组成部分
抗生素/抗真菌药组合	生前者	ANT-PM-2	普莫辛（100倍）
B27,50倍	生命科技	17504-044	培养基的组成部分
细胞培养插入件	科宁	3470	透孔，PET膜，0.4微米孔径，24孔板
CHIR 99021	托克里斯	4423	GSK3β抑制剂
来自人类胎盘的第四号胶原蛋白	西格玛	C5533
Cultrex 类器官采集溶液	特雷维根	3700-100-01	去聚合基底膜基质
乙醇，绝对	法姆科	111000200
GlutaMAX	生命科技	35050-061	L-异戊酰-L-谷氨酰胺二肽，200 mM
HEK293T/Noggin-Fc 细胞系	范登布林克实验室，提特加特肝脏与肠道研究所		用于生产Noggin调质培养基
HEK293T/RSPO1-Fc-HA 细胞系	特雷维根	3710-001-K	用于生产Rspondin-1调制介质
HEPES，1 M	生命科技	15630-080	培养基的组成部分
人类表皮生长因子（EGF）	研发系统	236-EG-01M	培养基的组成部分
倒置细胞培养光学显微镜	奥林匹斯	CKX51
L-WNT3A细胞系	空军交通管制委员会	CRL-2647	用于生产Wnt3a调控培养基
母毛菌，生长因子还原	科宁	356231	用于三维培养的基底膜基质
迷你细胞刮刀	联合生物系统	MCS-200
MUC2抗体，小鼠单克隆	阿布卡姆	AB11197	使用1：100进行免疫染色，1：500用于免疫印迹
MUC2 shRNA 慢病毒颗粒	通用电气达摩孔	RHS4531	GIPZ慢病毒shRNA，编号：4583
轨道震动器	格兰特仪器	电源-10i
青霉素-链霉素，100倍	生命科技	15140-122	培养基的组成部分
带微型喷头的探头超声器	布兰森超声波	450
哺乳动物细胞蛋白酶抑制剂组合	西格玛	P8340	裂解缓冲液的组成部分
SB 202190	托克里斯	1264	p38 MAPK抑制剂
氯化钠	西格玛	S3014	裂解缓冲液的组成部分
右旋酰甲酸钠	西格玛	D6750	裂解缓冲液的组成部分
十二烷基硫酸钠	西格玛	L3771	裂解缓冲液的组成部分
TrypLE快车，1次	生命科技	12605-010	胰蛋白酶，用于消化肠状体/结肠碎片
长针素抗体，兔子单克隆	阿布卡姆	AB129002	用1：1000进行免疫印迹
水，组织培养级，无菌过滤	科宁	25-055
Y-27632	托克里斯	1254	RhoA/ROCK抑制剂